Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.4. Xác định hàm lượng kháng thể có trong máu
Phương pháp tách lấy huyết thanh
Định kì lấy máu lợn hàng tuần để kiểm tra hàm lượng kháng thể có trong máu dùng kim tiêm lấy khoảng 2ml máu ở vịnh tĩnh mạch cổ của lợn thí nghiệm, để máu trong ống tiêm sạch nghiêng khoảng 300C để huyết khối hình thành dọc theo thành ống. Đậy nắp, để yên tĩnh ở nhiệt độ phòng 5 đến 6 giờ, chắt lấy huyết thanh (khi cần ly tâm 5.000 vòng/ phút trong vòng 10 phút trước khi hút huyết thanh). Pha azide natri 1: 20.000 để chống nhiễm khuẩn, nút kín, đánh dấu và bảo quản ở -200C cho đến khi làm xét nghiệm.
Hàm lượng kháng thể có trong máu được xác định bằng phương pháp ELISA.
Phương pháp ELISA
Các bước thực hiện phản ứng ELISA:
Bước 1: chuẩn bị các dụng cụ của bộ test ELISA để ở nhiệt độ phòng. Lấy từ trong túi ra tấm dụng cụ có các giếng có tấm kháng nguyên.
Bước 2: bổ sung 100µl mẫu pha loãng trong DWP (Deep-well-plate) vào trong các giếng.
Bổ sung thêm 100µl thuốc thử đối chứng dương và đối chứng âm vào các giếng xác định.
Bổ sung 100µl mẫu đã pha loãng ở trên, ủ tấm kháng nguyên trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Rửa tấm phủ kháng nguyên sau khi ủ ở bước 4, 3 lần mỗi lần 300µl dung dịch đệm Washing Buffer.
Quá trình rửa hoàn tất khi dùng khăn giấy lau nhẹ để loại bỏ hoàn toàn bộ đệm còn sót lại.
Bước 3: thêm 100µl HRPO anti-swine IgG Conjugate vào từng giếng và ủ ấm trong vòng 30 phút.
Rửa tấm kháng nguyên 3 lần ở bước 7 như rửa ở bước 5 và bước 6.
Bước 4: thêm 100µl TMB substrate. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng nếu phản ứng dương tính tấm phủ kháng nguyên sẽ nổi rõ màu xanh lá cây.
Bước 5: thêm vào 50µl Stop solution để dừng phản ứng. Màu sắc sẽ thay đổi sang màu vàng.
Bước 6: đọc kết quả: Độ hấp thụ quang (OD) bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm.
Kết quả:
Kết quả đạt yêu cầu khi:
* OD của đối chứng dương (PC) ≥ 0,5 * OD của đối chứng âm (NC) ≤ 0,3 Tính toán:
CPC = OD (đối chứng dương (PC)) – OD (đối chứng âm (NC)) SP = OD (của mẫu) – OD (đối chứng âm (NC))
+ Nếu SP ≥ 0,4 dương tính (0,4 ≤ SP < 0,8 (+); 0,8 ≤ SP < 1,5 (++); 1,5 ≤ SP (+++)).
+ Nếu 0,3 ≤ SP < 0,4 nghi ngờ. + Nếu SP < 0,3 âm tính.