Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.3. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong nghiên cứu virus học
Nghiên cứu tiếp truyền đời virus trên môi trường nuôi cấy (thường là môi trường tế bào) hoặc tiếp truyền trên động vật thí nghiệm là phương pháp thường quy trong nghiên cứu virus học nhằm kiểm tra đặc tính sinh học của virus, đặc biệt là về độc lực. Thông thường, khi tiếp truyền virus qua nhiều đời nuôi cấy, độc lực virus sẽ bị giảm cho tới một ngưỡng ổn định. Lúc này chủng virus bắt đầu được coi là ổn định về tính nhược độc và có thể sử dụng cho nghiên cứu sản xuất vacxin nếu cấu trúc phân tử của virus vẫn ổn định sau nhiều đời tiếp truyền.
Virus gây PRRS có đặc điểm là chỉ gây bệnh trên lợn. Do vậy, việc sử dụng động vật thí nghiệm đồng thời cũng là bản động vật trong trường hợp mục đích nghiên cứu tiếp truyền để tạo sự ổn định về tính nhược độc cho chủng virus PRRS là không khả thi. Việc sử dụng tế bào nuôi cấy virus trở thành lựa chọn duy nhất cho nghiên cứu tiếp truyền virus PRRS trong trường hợp này.
Có nhiều dòng tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy virus. Tuy nhiên virus PRRS chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang lợn (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) và tế bào thận khỉ (MARC-145, CL2621). Tuy nhiên theo Yoon và Stevenson (1999) thì không phải tất cả virus PRRS đều phát triển ở cả hai loại tế bào này mà PAM nhạy cảm với virus hơn so với CL2621, đặc biệt khi mẫu được dùng là huyết thanh. Còn Han-Kook Chung và cs (2002) cho rằng PRRSV chủng Châu Mỹ phát triển tốt hơn trên MARC-145, ngược lại PRRSV chủng Châu Âu lại phát triển nhanh hơn trên PAM. Theo những nghiên cứu về dịch tễ học phân tử thì virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam có độ tương đồng cao với virus PRRS chủng Châu Mỹ hơn là với virus PRRS chủng Châu Âu. Vì thế dòng tế bào MARC-145 đã từng được lựa chọn trong hầu hết những nghiên cứu về PRRSV tại Việt Nam. Trong khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, tiếp nối những kết quả nghiên cứu trước đó, chúng tôi cũng đã lựa chọn dòng tế bào MARC-145 cho nghiên cứu tiếp truyền virus KTY-PPRR-08 để làm giảm độc lực cho đến khi chủng virus trở thành nhược độc và ổn định để có thể đáp ứng cho nghiên cứu sản xuất vacxin.
2.3.1. Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy tế bào yêu cầu cao về mức độ dinh dưỡng nhằm tạo điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của tế bào. Môi trường có thể được cung cấp dưới dạng dung dịch để sử dụng ngay hay dưới dạng dung dịch đậm đặc hoặc
dạng bột. Dạng dung dịch đậm đặc có thể sử dụng sau khi pha loãng với nước cất tiệt trùng, trong khi dạng bột phải được hòa tan trong nước và tiệt trùng bằng cách lọc qua lưới lọc 0,22 µm.
Carbonhydrate: glucose (5 - 10 mM) được dùng trong hầu hết các công thức để cung cấp nguồn năng lượng cũng như tiền chất cho tổng hợp sinh học. Có thể dùng fructose thay thế cho glucose. Glucose có trong hầu hết môi trường là nguồn ly giải tạo pyruvat vào chu trình acid citric và sinh ra CO2.
Amino acid (0,1 – 0,2 mM) cũng được dùng như là nguồn tiền chất cho tổng hợp protein. Glutamine thường được sử dụng nhưng lại bị chuyển hóa thành amoniac có thể ức chế sự sinh trưởng trong một số quá trình nuôi cấy.
Muối được sử dụng làm cho môi trường có tính đẳng trương, duy trì sự cân bằng giữa nội bào và môi trường nuôi cấy.
Bicarbonate (NaHCO3) được sử dụng như là một hệ đệm và kết hợp với 5- 10% CO2 từ tủ ấm cho phép duy trì pH môi trường từ 7,2 – 7,4.
Vitamin và hormone được sử dụng với hàm lượng thấp nhằm mục đích kích thích sinh trưởng. Lượng vitamin và hormone thay đổi khác nhau tùy thuộc vào công thức của những môi trường khác nhau.
Huyết thanh được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cải thiện sự sinh trưởng của tế bào, giúp tế bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh và phát triển mạnh hơn. Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum – FBS) thường được sử dụng bổ sung vào cho môi trường nuôi cấy, nhưng lại đắt tiền và hiếm. Nồng độ huyết thanh thường được dùng từ 5-20%. Những dòng tế bào liên tục có xu hướng thích nghi với môi trường có nồng độ huyết thanh thấp. Những protein có trong huyết thanh như albumin, fibronectin, globulin giúp tế bào bám dính và phát triển.
Kháng sinh thường được cho vào môi trường nuôi cấy trong thời gian ngắn nhằm làm giảm nguy cơ tạp nhiễm. Nồng độ tối ưu của kháng sinh được xác định theo kinh nghiệm của người tiến hành nuôi cấy.
2.3.2. Điều kiện nuôi cấy
Hầu hết tế bào trong môi trường nuôi cấy sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 370C và pH = 7,4. Nếu ở nhiệt độ thấp hơn một chút so với 370C thì tốc độ sinh trưởng sẽ giảm xuống nhưng tế bào không bị phá hủy. Còn đối với nhiệt độ cao hơn, từ
39-40oC sẽ phá hủy tế bào. Do vậy đảm bảo sự ổn định của nhiệt độ (đặc biệt không được tăng bất thường) trong tủ cấy là rất quan trọng.
Do môi trường nuôi cấy tế bào cực kỳ giàu dinh dưỡng nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra. Sự tạp nhiễm thường do tiệt trùng dụng cụ không đạt yêu cầu hoặc bắt nguồn từ tiếp xúc của con người như từ bàn tay, hơi thở, tóc. Để hạn chế sự tạp nhiễm, cần lưu ý loại trừ những nguy cơ nêu trên bằng cách sử dụng trang thiết bị có độ an toàn sinh học cao, dụng cụ tiệt trùng dùng một lần.
2.3.3. Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào
- Kỹ thuật nuôi cấy tế bào một lớp: Kết quả nuôi cấy sẽ được một lớp tế bào trên hộp nuôi (thường là flask).
- Kỹ thuật nuôi cấy tế bào nhiều lớp: Kết quả được từ 2 lớp tế bào trở lên. - Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trên nồi lên men: (nuôi cấy chìm) tế bào lơ lửng hoặc được cố định trên giá thể tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng và phân chia, đến khi đạt nồng độ cần thiết thì lấy tế bào đem đi xử lý theo yêu cầu công việc. Tế bào được nuôi cấy liên tục hoặc bán liên tục.
Sau đó cho virus xâm nhiễm tế bào và nhân lên, phá hủy tế bào (một số virus không phá vỡ tế bào) – xử lý – thu hoạch virus.
2.3.4. Khả năng tiếp truyền virus PRRS trên dòng tế bào MARC-145
Năm 2010, sau khi có kết quả so sánh về sự tương đồng giữa chủng virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam và chủng PRRS tại Trung Quốc, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã quyết định nhập khẩu vacxin phòng PRRS từ Trung Quốc. Đây là loại vacxin nhược độc đông khô chủng JXA1-R sản xuất từ chủng virus độc lực cao (Phạm Xuân Bảo, 2013). Vacxin JXA1-R cũng là dòng vacxin được nhược độc hóa qua nhiều lần tiếp truyền trên tế bào MARC-145. Lúc đầu chủng virus JXA1 là chủng virus cường độc, sau 82 đời tiếp truyền trên tế bào MARC-145, chủng virus này trở nên nhược độc và được sử dụng để sản xuất vacxin. Chỉ số TCID50 của chủng virus này ổn định ở mức độ TCID50/ml ≥ 104.0 (Yu et al., 2015).
Một chủng virus PRRS cường độc khác phân lập tại Trung Quốc cũng được sử dụng trong nghiên cứu là chủng TJ. Chủng virus PRRS này sau khi tiếp truyền qua 92 đời tế bào MARC-145 đã đạt tiêu chuẩn trở thành chủng nhược độc và được thử nghiệm cho công việc sản xuất vacxin (Leng et al., 2012)
Năm 2015, công ty Hanvet cũng đã công bố về sản phẩm vacxin phòng PRRS của công ty được sản xuất từ chủng Hanvet1.VN. Chủng virus này được phân lập tại ổ dịch xã Chỉ Đạo (Văn Lâm, Hưng Yên) và làm nhược độc bằng cách cấy chuyển liên tục trên dòng tế bào MARC-145. Cứ cách 10 đời thì tiến hành chuẩn độ hiệu giá virus một lần để kiểm tra hàm lượng virus. Đến khi cấy truyền 60-80 đới thì chủng virus đã trở nên nhược độc hoàn toàn và không còn khả năng gây bệnh cho lợn. (Chu Khôi, 2015).
Vấn đề đáng quan tâm khi sử dụng vacxin nhược độc nói chung và vacxin phòng PRRS nói riêng là khả năng biến đổi của chủng virus vacxin sau khi tiêm cho bản động vật. Liệu có khả năng độc lực của virus hồi phục trở về cường độc hay không và khả năng này được đánh giá như thế nào. Năm 2004, Grebennikova và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu genotype và phenotype trên chủng virus PRRS NADC-8 và tạm thời phân chia độc lực của chủng virus này thành 3 loại bao gồm độc lực cao (virulent), độc lực trung bình (intermediate) và không có độc lực (avirulent). Theo đó, nhóm virus không có độc lực bắt nguồn từ việc tiếp truyền nhiều đời virus có độc lực qua tế bào còn chủng có độc lực trung bình bắt nguồn từ chủng virus nhược độc nhưng sau đó tiếp truyền đời virus trên lợn (là bản động vật của virus gây PRRS). Sự khác biệt về nucleo tit giữa chủng cường độc và chủng nhược độc là 50 nucleotit và sự thiếu hụt 3 nucleotit. Đối với chủng nhược độc và chủng có độc lực trung bình, sự khác biệt nằm ở 8 nucleotit thay đổi và gây ra thay đổi ở 6 amino acid. Ba trong 6 sự thay đổi amino acid này dẫn đến việc virus biến đổi dần trở lại thành chủng cường độc. Sự biến đổi về gen nằm ở vùng đọc mở ORF (Open Reading Frame) số 1a, 1b và 6 (ORF1a, ORF1b và ORF6). Đáng lưu ý là việc chuyển hóa về gen của virus được phát hiện ngay cả khi virus PRRS đã từng được tiếp truyền 251 đời trên môi trường tế bào MARC-145 và chỉ chuyển tiếp 1 đời qua bản động vật. Những nghiên cứu sâu hơn cho thấy có sự liên quan giữa những đột biến về genome của virus PRRS với sự thay đổi về nồng độ của những nguyên tố vi lượng trong môi trường nuôi cấy tế bào (Ni, Mn và Fe) (Grebennikova et al., 2005).