Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp tiếp truyền virus trên tế bào MARC-145
3.5.1.1. Chuẩn bị tế bào
• Gọi tế bào từ dạng tế bào được bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: môi trường DMEM bổ sung 5% FCS làm ấm trong tủ 370C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy.
Bước 1: giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FCS, chuyển tế bào và bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường DMEM + 5% FCS. Đóng chặt bình nuôi cấy lại, ghi tên tế bào và ngày gọi đậy lên nắp bình nuôi cấy.
Bước 4: giữ tế bào ở tủ ấm 370C với 5% CO2, hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào. Khi thấy tế bào mọc dày, kín bề mặt đáy bình là có thể thu tế bào để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào sang bình nuôi cấy mới.
• Cấy chuyển tế bào
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu.
Bước 1: loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS.
Bước 2: trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin-EDTA. Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: loại bỏ Trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng.
Bước 4: cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml môi trường đầy đủ. Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào trong 1ml.
Bước 5: cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/bình T75).
Bước 6: nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C, 5% CO2
hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
3.5.1.2. Gây nhiễm virus và cấy chuyển qua các đời
Tế bào MARC-145 được chuẩn bị như phần trên đã trình bày.
• Gây nhiễm virus PRRS
Khi tế bào trong giếng đã chuẩn bị cho việc tiến hành gây nhiễm mọc kín hầu hết mặt giếng nuôi thì hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 100µl mẫu đã chuẩn bị. Hỗn dịch virus tế bào được ủ ở 370C với 5% CO2 trong 60 phút.
Bổ sung 1,5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các giếng nuôi và ủ ở 370C với 5% CO2.
Hằng ngày theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi ngược và tiến hành cấy chuyển qua các đời virus khi chúng phá hủy 80-90% tế bào gây nhiễm.
• Cấy chuyển virus qua các đời
Trong quá trình theo dõi CPE của chủng virus ở đời cấy chuyển thứ nhất, đồng thời chúng tôi cũng tiến hành nuôi cấy tế bào ở các bình T25 khác để chuẩn bị cho việc gây nhiễm virus ở đời tiếp theo.
Khi Virus ở đời 1 phá hủy 80-90% tế bào gây nhiễm thì hút bỏ môi trường nuôi cấy ở các bình T25 chưa gây nhiễm, hút 0,1ml virus từ các bình T25 ở đời trước đó sang, ủ ở 37°C với 5% CO2 trong 60 phút.
Rồi bổ sung 5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các bình T25 để các bình nuôi này ở 370C với 5% CO2.
Hàng ngày theo dõi sự phá hủy tế bào bằng kính hiển vi soi ngược và thu lại virus sau thời gian 4 ngày để đánh giá hiệu giá virus.
3.5.1.3. Nghiên cứu tính thích ứng của PRRS trên tế bào MARC-145
Sau 4 ngày gây nhiễm virus, tế bào gây nhiễm virus được đông tan 3 lần và được ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, ở điều kiện 400C để loại bỏ cặn tế bào. Huyễn dịch sau khi ly tâm sẽ đuọc cấy truyền đời tiếp trên môi trường tế bào
MARC-145 để xác định tính thích nghi của virus. Các bước thực hiện được tóm tắt như sau:
Hút hết môi trường cũ ra khỏi chai nuôi cấy tế bào bằng máy hút chân không.
Bổ sung 3ml PBS vào chai nuôi cấy, láng đều khắp mặt chai để rửa hết tế bào chết trong chai. Sau khi rửa xong, loại bỏ PBS.
Dung lọc vô trùng 0,45µl lọc 1ml dịch virus cho vào chai nuôi cấy. Ủ tế bào và huyễn dịch gây nhiễm ở 37oC, 5%CO2 trong vòng 1-2 giờ. Loại bỏ toàn bộ huyễn dịch gây nhiễm.
Cho 3ml PBS vào chai để rửa tế bào. Tiến hành rửa 2 lần.
Cho 5ml môi trường DMEM/chai T25. Sau đó nuôi cấy trong tủ 37oC có 5%CO2 trong 72 giờ. Quan sát bệnh tích tế bào (CPE) hàng ngày, theo dõi thời gian virus phá huỷ tế bào. Sau 10 đời cấy truyền trên môi trường tế bào, virus PRRS sẽ được chuẩn đoán bằng kỹ thuật PT-PCR.
3.5.1.4. Phương pháp xác định hiệu giá virus trên môi trường tế bào
TCID50 (50% The Tissue culture Infectious Dose) là phương pháp xác định hiệu giá virus dựa trên điểm tới hạn (end poit) cho biết liều virus tại đó gây huỷ hoại 50% số giếng tế bào (Karber Formula). Ví dụ: khi nói nồng độ virus trong thí nghiệm TCID50 là 103 TCID50/ml ghi nhận sau 4 ngày theo dõi thí nghiệm có nghĩa là ở nồng độ pha loãng 1.000 lần thì 1ml dịch virus có khả năng huỷ hoại 50% số giếng tế bào sau 4 ngày xâm nhiễm.
Để tính hiệu giá các chủng virus PRRS phân lập được ta tiến hành chuẩn độ như sau:
Tế bào MARC-145 một lớp được chuẩn bị trên khay 96 giếng. Mỗi giếng chứa 2,0 x 104 tế bào, dịch môi trường được hút bỏ. Huyễn dịch chứa bệnh phẩm được ly tâm bỏ cặn, lấy phần nước trong pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp các giếng theo thứ tự đánh dấu trước (25 µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM có chứa 5% FBS được bổ sung vào các giếng tế bào đã gây nhiễm virus (100 µl/giếng).
Bệnh tích tế bào (CPE-Cyto Pathogenic Effect) được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm. TCID50 được xác định theo phương pháp Behrens-Karber (Nguyễn Thị Lan và cs., 2005).