3.3.1. Nguyên liệu
Chủng virus KTY–PRRS–08 được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y khoa Thú y.
3.3.2. Động vật thí nghiệm
Thí nghiệm gồm 6 con lợn 2-3 tuần tuổi không nhiễm PRRS, không có chứa kháng thể kháng PRRSV.
3.3.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
- Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất thường quy cho phòng thí nghiệm virus học và nuôi cấy tế bào: Tủ lạnh âm sâu, máy ly tâm, micropipet, seringer, PBS, tế bào MARC-145, DMEM, ...
- Các trang thiết bị, dụng cụ hóa chất, máy móc sử dụng trong phản ứng ELISA, máy đo chỉ tiêu huyết học CELL-DYN3700.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc từ chủng virus cường độc KTY- PRRS-08 trên môi trường MARC-145.
Nghiên cứu đặc tính sinh học của virus KTY-PRRS-08 qua các đời nuôi cấy.
Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của virus KTY-PRRS-08 qua các đời nuôi cấy.
Nghiên cứu tính kháng nguyên của virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển trên môi trường MARC-145 ở đời 90.
Nghiên cứu về độc lực của chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển trên môi trường MARC-145 ở đời 90.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
3.5.1. Phương pháp tiếp truyền virus trên tế bào MARC-145
3.5.1.1. Chuẩn bị tế bào
• Gọi tế bào từ dạng tế bào được bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: môi trường DMEM bổ sung 5% FCS làm ấm trong tủ 370C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy.
Bước 1: giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FCS, chuyển tế bào và bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường DMEM + 5% FCS. Đóng chặt bình nuôi cấy lại, ghi tên tế bào và ngày gọi đậy lên nắp bình nuôi cấy.
Bước 4: giữ tế bào ở tủ ấm 370C với 5% CO2, hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào. Khi thấy tế bào mọc dày, kín bề mặt đáy bình là có thể thu tế bào để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào sang bình nuôi cấy mới.
• Cấy chuyển tế bào
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu.
Bước 1: loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS.
Bước 2: trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin-EDTA. Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: loại bỏ Trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng.
Bước 4: cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml môi trường đầy đủ. Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào trong 1ml.
Bước 5: cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/bình T75).
Bước 6: nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C, 5% CO2
hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
3.5.1.2. Gây nhiễm virus và cấy chuyển qua các đời
Tế bào MARC-145 được chuẩn bị như phần trên đã trình bày.
• Gây nhiễm virus PRRS
Khi tế bào trong giếng đã chuẩn bị cho việc tiến hành gây nhiễm mọc kín hầu hết mặt giếng nuôi thì hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 100µl mẫu đã chuẩn bị. Hỗn dịch virus tế bào được ủ ở 370C với 5% CO2 trong 60 phút.
Bổ sung 1,5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các giếng nuôi và ủ ở 370C với 5% CO2.
Hằng ngày theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi ngược và tiến hành cấy chuyển qua các đời virus khi chúng phá hủy 80-90% tế bào gây nhiễm.
• Cấy chuyển virus qua các đời
Trong quá trình theo dõi CPE của chủng virus ở đời cấy chuyển thứ nhất, đồng thời chúng tôi cũng tiến hành nuôi cấy tế bào ở các bình T25 khác để chuẩn bị cho việc gây nhiễm virus ở đời tiếp theo.
Khi Virus ở đời 1 phá hủy 80-90% tế bào gây nhiễm thì hút bỏ môi trường nuôi cấy ở các bình T25 chưa gây nhiễm, hút 0,1ml virus từ các bình T25 ở đời trước đó sang, ủ ở 37°C với 5% CO2 trong 60 phút.
Rồi bổ sung 5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các bình T25 để các bình nuôi này ở 370C với 5% CO2.
Hàng ngày theo dõi sự phá hủy tế bào bằng kính hiển vi soi ngược và thu lại virus sau thời gian 4 ngày để đánh giá hiệu giá virus.
3.5.1.3. Nghiên cứu tính thích ứng của PRRS trên tế bào MARC-145
Sau 4 ngày gây nhiễm virus, tế bào gây nhiễm virus được đông tan 3 lần và được ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, ở điều kiện 400C để loại bỏ cặn tế bào. Huyễn dịch sau khi ly tâm sẽ đuọc cấy truyền đời tiếp trên môi trường tế bào
MARC-145 để xác định tính thích nghi của virus. Các bước thực hiện được tóm tắt như sau:
Hút hết môi trường cũ ra khỏi chai nuôi cấy tế bào bằng máy hút chân không.
Bổ sung 3ml PBS vào chai nuôi cấy, láng đều khắp mặt chai để rửa hết tế bào chết trong chai. Sau khi rửa xong, loại bỏ PBS.
Dung lọc vô trùng 0,45µl lọc 1ml dịch virus cho vào chai nuôi cấy. Ủ tế bào và huyễn dịch gây nhiễm ở 37oC, 5%CO2 trong vòng 1-2 giờ. Loại bỏ toàn bộ huyễn dịch gây nhiễm.
Cho 3ml PBS vào chai để rửa tế bào. Tiến hành rửa 2 lần.
Cho 5ml môi trường DMEM/chai T25. Sau đó nuôi cấy trong tủ 37oC có 5%CO2 trong 72 giờ. Quan sát bệnh tích tế bào (CPE) hàng ngày, theo dõi thời gian virus phá huỷ tế bào. Sau 10 đời cấy truyền trên môi trường tế bào, virus PRRS sẽ được chuẩn đoán bằng kỹ thuật PT-PCR.
3.5.1.4. Phương pháp xác định hiệu giá virus trên môi trường tế bào
TCID50 (50% The Tissue culture Infectious Dose) là phương pháp xác định hiệu giá virus dựa trên điểm tới hạn (end poit) cho biết liều virus tại đó gây huỷ hoại 50% số giếng tế bào (Karber Formula). Ví dụ: khi nói nồng độ virus trong thí nghiệm TCID50 là 103 TCID50/ml ghi nhận sau 4 ngày theo dõi thí nghiệm có nghĩa là ở nồng độ pha loãng 1.000 lần thì 1ml dịch virus có khả năng huỷ hoại 50% số giếng tế bào sau 4 ngày xâm nhiễm.
Để tính hiệu giá các chủng virus PRRS phân lập được ta tiến hành chuẩn độ như sau:
Tế bào MARC-145 một lớp được chuẩn bị trên khay 96 giếng. Mỗi giếng chứa 2,0 x 104 tế bào, dịch môi trường được hút bỏ. Huyễn dịch chứa bệnh phẩm được ly tâm bỏ cặn, lấy phần nước trong pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp các giếng theo thứ tự đánh dấu trước (25 µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM có chứa 5% FBS được bổ sung vào các giếng tế bào đã gây nhiễm virus (100 µl/giếng).
Bệnh tích tế bào (CPE-Cyto Pathogenic Effect) được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm. TCID50 được xác định theo phương pháp Behrens-Karber (Nguyễn Thị Lan và cs., 2005).
3.5.2. Giám định virus PRRS bằng phương pháp RT-PCR
3.5.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số bằng hóa chất
Hóa chất cần chuẩn bị: Trizol, Chloroform, Isopropyl alcohol (2- propanol), Ethanol 75%, Rnase – free water.
Các bước tiến hành:
Bước 1: lấy 100µl virus PRRS vào ống eppendorf 1.5ml.
Bước 2: bổ sung 1ml of Trizol vào ống trên và lắc đều, giữ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 3: bổ sung thêm 0.2ml chloroform vào ống và lắc đều giữ 3 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 4: ly tâm dung dịch ở 12.000 vòng trong 15 phút ở 40C.
Bước 5: chuyển 350µl dịch nổi phía trên sang ống mới và bổ sung 500µl isopropyl alcohol, giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 6: ly tâm dung dịch ở 12.000 vòng trong 10 phút ở 40C.
Bước 7: loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn, bổ sung 1ml ethanol 75% lặc đều, ly tâm dung dịch ở 7.500 vòng trong 5 phút ở 40C.
Bước 8: loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Bước 9: bổ sung 50µl Rnase – free water, lắc đều và bảo quản RNA.
3.5.2.2. Phương pháp RT-PCR
Các bước tiến hành phản ứng RT- PCR: mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Primer Forward 0,5 Primer Reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR:
Mồi xuôi ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC Mồi ngược CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC CGC
Các mồi này nhằm khuếch đại đoạn gen ORF5 có kích thước 603bp của virus PRRS.
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt ở bảng 3.2. Sản phẩm của phản ứng RT- PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
Bảng 3.2. Các bước thực hiện phản ứng RT-PCR
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1 Duỗi mạch 95 5 phút 2 Duỗi mạch 95 15 giây 35 Gắn mồi 50 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞ 3.5.2.3. Phương pháp điện di
Phương pháp điện di được thực hiện theo các bước sau: Bước 1: chuẩn bị dung dịch đệm và nhuộm bản gel.
Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE hoặc TAE, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng TBE và agarose để tạo bản gel.
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong vòng 5 phút, làm nguội đến 600C. Sau đó dung pipet hút 3µl thuốc nhuộm Ethidium bromide. Lắc đều và đổ vào khuôn các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bản điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm.
Bước 2: tra mẫu điện di.
Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT – PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4 – 6µl DNA Marker.
Bước 3: chạy điện di.
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: đọc kết quả.
Sau khi chạy điện di xong chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.5.2.4. Phương pháp giải trình tự gen
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNA. Giải trình tự bộ gen người, động vật và vi sinh vật giúp chẩn đoán bệnh tật và nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất, phục vụ lợi ích con người. Có 3 nhóm phương pháp giải trình gen chủ yếu: Phương pháp Maxam và Gilbert, phương pháp Dideoxy (còn gọi là phương pháp Sanger) và phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động.
Quá trình thực hiện giải trình tự gen bao gồm các bước sau:
• Tinh sạch sản phẩm RT - PCR
Sau phản ứng RT-PCR, một lượng lớn phân tử DNA của vùng cần nghiên cứu đã được nhân lên. Sản phẩm tinh sạch được dùng để giải trình tự trực tiếp nên cần phải tiến hành tinh sạch sản phẩm sau phản ứng RT-PCR để loại bỏ tạp chất (1 lượng primer, dNTP dư và enzyme DNA polymerase). Chúng tôi tinh sạch sản phẩm RT-PCR sử dụng bộ hóa chất của hãng Bioneer, tiến hành theo hướng dẫn sau:
Bước 1: cho vào ống Eppendorf sản phẩm RT-PCR vào dung dịch PB theo tỷ lệ 1:5 sau đó trộn đều.
Bước 2: chuyển toàn bộ dung dịch sang cột lọc và li tâm 13.000 vòng/phút, trong 1 phút ở 280C. Rồi bỏ dịch ở đáy ống giữ cột.
Bước 3: thêm 500µl WB lên cột. Li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ nước giữ cột. Sau đó li tâm thêm một lần nữa 13.000 vòng/phút, trong 1 phút.
Bước 4: chuyển cột sang một ống eppendorf loại 1,5ml sạch, thêm 3µl dung dịch EL, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó li tâm 11.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lấy nước dưới. Dịch bên dưới chính là sản phẩm RT-PCR đã được tinh sạch. Ký hiệu mẫu và bảo quản -200C.
• Thực hiện phản ứng PCR sequencing
Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml theo ba gồm: DTCS Quick start master Mix, DN, Primer, DH2O. sau đó tinh sạch sản phẩm PCR sequence để giải trình tự.
• Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR-sequencing.
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter –Mỹ).
Các bước tinh sạch sản phẩm như sau:
Bước 1: sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được bổ sung Sodium acetate, EDTA Na2 và glycogen.
Bước 2: bổ sung cồn 1000 trong điều kiện lạnh và tiến hành ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi trên ống và giữ lại cặn DNA.
Bước 3: bổ sung cồn 750, tiến hành ly tâm ở 14.000 vòng/ phút trong 2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn.
Bước 4: bổ sung SLS vào mỗi mẫu và trộn đều.
Sản phẩm sau khi tinh sạch được chuyển vào đĩa chạy mẫu để tiến hành giải trình tự gen.
3.5.2.5. Phương pháp đọc kết quả giải trình tự gen
Phân tích xác nhận chuỗi gen thu được qua chương trình Blast trên ngân hàng gen (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Truy cập ngân hàng gen thu nhận và xác định tính tương đồng về nucleotide của các chuỗi gen tương ứng của virus với các phân đoạn gen thu được trong nghiên cứu. Thu thập và xử lý bằng chương trình MEGA5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.10) để so sánh mức độ tương đồng về nucleotide và amino acid.
3.5.3. Bố trí thí nghiệm
- Số lợn được nuôi: 6 con - Độ tuổi của lợn: 2-3 tuần tuổi
- Tình trạng sức khỏe: không nhiễm PRRS, không có chứa kháng thể
kháng PRRSV.
Tiến hành nghiên cứu 6 lợn thí nghiệm được chia làm 2 lô: lô thí nghiệm gồm 3 con và lô đối chứng gồm 3 con.
Trước khi gây bệnh thực nghiệm, theo dõi nhiệt độ, tình trạng sức khỏe lợn thí nghiệm trước khi gây nhiễm 7 ngày. Tiến hành lấy máu, chắt huyết thanh kiểm tra kháng thể PRRS bằng phương pháp ELISA, đồng thời kiểm tra sự có mặt của virus PRRS và một số virus khác bằng phương pháp RT – PCR để khẳng định lợn thí nghiệm chưa từng tiếp xúc với virus PRRS.
Mỗi lợn được gây bệnh bằng chủng KTY-PRRS-08 với liều 2ml/con bơm qua đường nhỏ mũi. Sau khi gây bệnh, theo dõi lợn hàng ngày, đo thân nhiệt 3 lần/ ngày vào 8 giờ, 11 giờ và 17 giờ, đồng thời tiến hành lấy máu đếm số lượng bạch cầu kiểm tra hàm lượng kháng thể vào ngày thứ 3, 7,10, 14, 21.
Tiến hành mổ khám lợn khi lợn thí nghiệm chết hoặc kết thúc thí nghiệm (28 ngày sau gây nhiễm). Khi mổ khám, kiểm tra bệnh tích đại thể, làm tiêu bản bệnh lý nhộm HE quan sát bệnh tích vi thể.
36 B ản g 3. 3. B ản g b ố tr í t h í n gi ệm L ô N gà y T rư ớc ti êm S au ti êm -7 - 6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Đ C L M