4. Những đóng góp mới của luận án
1.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa hệ gen
Có nhiều phương pháp dùng để đánh giá hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa hệ gen như hệ thống biểu hiện tạm thời, sử dụng tế bào trần, hệ thống nuôi cấy rễ tơ. Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng đối tượng nghiên cứu mà các nhà khoa học lựa chọn các phương pháp tối ưu.
1.3.4.1 Đánh giá hiệu quả hoạt đồng của hệ thống CRISPR/Cas9 qua biểu hiện tạm thời
Bước quan trọng trong nghiên cứu chỉnh sửa hệ gen là đánh giá hoạt động của hệ thống vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9. Các nghiên cứu đầu tiên đã sử dụng hệ thống biểu hiện tạm thời trên lá để đánh giá hoạt động của các hệ thống CRISPR/Cas9 đã được thiết kế. Cụ thể các nhà khoa học đột biến có chủ đích đồng thời ba gen ở lúa mì bằng kỹ thuật CRISPR/Cas9, đồng thời họ thiết kế một phương pháp phát hiện nhanh đột biến thông qua sự biểu hiện lưỡng cực của gRNA và Cas9 có trong phôi lúa mì chưa trưởng thành. Sau đó các dạng đột biến được xác định bằng kỹ thuật PCR-RFLP ở tuần kế tiếp [67]. Hay sự biểu hiện tạm thời trên lá cây ca cao mang gen chuyển TcNPR3 biểu hiện kháng bệnh Phytophthora Tropicalis
được chuyển vào thông qua hệ thống CRISPR/Cas9, các đột biến được phát hiện thông qua việc giải trình gen [68].
1.3.4.2 Đánh giá hiệu quả hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9 sử dụng tế bào trần
Bên cạnh hệ thống biểu hiện tạm thời trên lá, hệ thống nuôi cấy tế bào trần cũng được ứng dụng nhiều trong đánh giá hoạt động của hệ thống chỉnh sửa hệ gen trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau thể hiện qua các công trình nghiên cứu như: Junpin Gao và cộng sự đã gây đột biến có mục tiêu hai gen (NtPDS và
NtPDR6) ở thuốc lá bằng kỹ thuật CRISPR/Cas9, sau đó họ kiểm tra nhanh hoạt động của hệ thống chỉnh sửa bộ gen này trong nguyên bào thuốc lá, đột biến chèn và xóa (indel) được ghi nhận với tần số từ 16,2% đến 20,3% sau khi truyền RNA dẫn đường (gRNA) và nuclease Cas9 trong nguyên bào thuốc lá. Kết quả cuối của nghiên cứu nhóm thu được cây thuốc lá chuyển gen với đột biến NtPDS và NtPDR6
do Cas9/gRNA gây ra. Tỉ lệ đột biến là 81,8% đối với NtPDS gRNA4 và 87,5% đối với NtPDR6 gRNA2, không thu được đột biến đáng kể ngoài mục tiêu [69]. Việc đánh giá hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa hệ gen thông qua tế bào trần còn được áp dụng trên cây nho, táo
1.3.4.3 Đánh giá hiệu quả hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9 thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ
Bên cạnh hệ thống biểu hiện tạm thời và hệ thống nuôi cấy tế bào trần, gần đây hệ thống nuôi cấy rễ tơ đã được ứng dụng thành công trong đánh giá hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen trên một số đối tượng cây trồng. Điển hình trên cây lạc, CRISPR/Cas9 được áp dụng nhằm loại bỏ hai gen AhNFR1 và AhNFR5 tạo nốt sần. Thông phương pháp tạo rễ tơ nhóm nghiên cứu đã đánh giá được hiệu quả hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9 đồng thời xác định được chức năng của gen AhNFR5 trong sự hình thành nốt sần ở cây [72].
Thông qua hệ thống biểu hiện rễ tơ trên cây rau diếp xoắn, hệ thống CRISPR/Cas9 được đánh giá có hiệu quả trong việc loại bỏ gen CiPDS, tần số đột biến là 4,5% đối với tế bào trần, 31,25% với biến nạp qua trung gian A. rhizogenes
với nhiều biallelic được phát hiện ở tất cả các cây mang đột biến [73]. Trên cây khoai tây hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ được sử dụng để đánh giá hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9 trong chỉnh sửa gen StPDS mã hoá cho enzyme liên quan đến việc tổng hợp các carotenoid, kết quả 64% - 98% dòng rễ tơ chuyển gen mang đột biến mục tiêu được biểu hiện, 14% –30% đột biến dạng thể khảm. Các đột biến được duy trì trong các dòng tái sinh là các đột biến ổn định với tỉ lệ trung bình là 38% và có khả năng truyền dòng mầm cho thế hệ con cháu [74].