4. Những đóng góp mới của luận án
2.3.4. Xác định và phân tích đột biến định hướng trên các gen đích của các
đậu tương
Đối với hệ rễ tơ hình thành từ cấu trúc mang gen chỉ thị gus sẽ được ngâm trong dung dịch X-Gluc và đặt trong tủ ổn nhiệt 37ºC qua đêm theo phương pháp của Jefferson và đồng tác giả [88]. Biểu hiện màu GUS (xanh lam) được quan sát, thống kê và chụp ảnh lưu giữ. Biểu hiện của gen gfp được kiểm tra bằng cách soi trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang (Oplympus- U-SPT (Japan-SZ X 12)), đoạn rễ tơ chứa cấu trúc chuyển gen sẽ phát sáng, độ phát sáng tùy thuộc vào biểu hiện của gen gfp. Các dòng rễ tơ in vitro được tách chiết DNA genome theo phương pháp CTAB của Doyle và cộng sự (1991).
Cặp mồi đặc hiệu Bar-F (5’-TACCATGAGCCCAGAACGACGCCC-3’); Bar-R (5’-TACCATGAGCCCAGAACGACGCCC-3’) được sử dụng kiểm tra sự có mặt của gen chọn lọc bar và cặp mồi Cas9-F (5’- GCCCAAGAGGAACAGCGATAAGC-3’); Cas9-R (5’-CAGTTCGCCGGCA GAGGCCAGC-3’) được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa protein Cas9 trong cấu trúc chuyển gen có trong rễ tơ in vitro.
Sản phẩm PCR được được kiểm tra và phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
2.3.4. Xác định và phân tích đột biến định hướng trên các gen đích của các dòngrễ tơ đậu tương rễ tơ đậu tương
gen GmGOLS03: G03F/R (5’-TGACGGAAATGGCCATGCTCCTG-3’/5’- CCCCGTATATCTCCATGGCTTGG-3’) và gen GmGOLS 19: G19F/R(5’- TCTTGATTGAGTAAGGTGTGAG-3’/5’-
GCGCCAGAGCATGGCAAGGAC-
3’). Sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% hoặc sử dụng cho phân tích biến tính hồi tính trên gel polyacrylamide 15% theo phương pháp của Zhou và cộng sự (2014) [89]. Cụ thể, các mồi đặc hiệu cho gen GmGOLS03 hoặc
GmGOLS19 sẽ được dùng để khuếch đại các dòng có thể mang đột biến và dòng không mang đột biến (WT). Thông qua phương pháp biến tính hồi tính hỗn hợp sản phẩm PCR của các dòng đột biến và WT, các DNA sợi đơn của dòng đột biến và WT sẽ sự kết hợp như Hình 2.2 A, kết quả xuất hiện băng vạch khi điện di trên gel polyacrylamide 15% (Hình 2.2 B).
Phương thức tiến hành như sau: (1) PCR độc lập các mẫu mẫu DNA của dòng đậu tương mang gen đột biến và dòng không mang đột biến (WT). (2) Trộn sản phẩm PCR của WT với mỗi dòng đột biến tỉ lệ 1:1. (3) Biến tính hỗn hợp nhiệt độ 950C trong 5 phút, sau đó hạ nhiệt độ về nhiệt độ phòng. (4) Phân tích sản phẩm trên gel polyacrylamide 15%.
Hình 2.1. Sơ đồ minh họa nguyên lý kỹ thuật biến tính hồi tính dùng trong sàng lọc đột biến gen
A. Minh hoạ các sự bắt cặp của các sợi đơn DNA của dòng đột biến và WT khi xử lý biến tính và hồi tính nhiệt; B.Minh họa sản phẩm biến tính và hồi tính trên bản gel
polyacrylamide 15%, vạch màu thể hiện các điểm đột biến trên DNA
Sản phẩm PCR gen đích của các dòng rễ tơ tiếp tục được tinh sạch và chuyển sang vector nhân bản pJET1.2 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) để giải trình tự bằng hệ thống ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer với bộ giải
chu trình Applied Biosystems Big Dye Terminator (Ứng dụng Biosytems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, Việt Nam.