4. Những đóng góp mới của luận án
3.4.2 Các dòng M3.1 và M4.1 của giống Marverick
3.4.2.1 Sự di truyền của gen chọn lọc bar ở thế hệ T1
Tương tự như giống ĐT26, bằng phương pháp phết thuốc diệt cỏ glufosinate nồng độ 200 mg/l để nhận diện gen bar và sàng lọc PCR sự có mặt của trình tự T- DNA sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen pcoCas9 và vùng mở rộng 35SPPDK – pFGC trong gen được tiến hành tương tự như thế hệ T1 của dòng DT1.1. Kết quả đã thu được 4 dòng đậu tương đột biến thế hệ T1 (M3.1-2, M3.1-6, M4.1-1, M4.1-5) của giống Mr không phản ứng với glufosinate 200 mg/l sau 5 ngày thực hiện phương pháp phết lá, kết quả ghi nhận tại Bảng phụ lục 2. Thông qua phương pháp điện di sản phẩm PCR của các mẫu T1 thu được với các cặp mồi đặc hiệu (Bảng phụ lục 1) trên gel agarose 1% đã ghi nhận băng vạch xuất hiện rõ nét ở 4 dòng (M3.1-2, M3.1- 6, M4.1-1, M4.1-5) thế hệ T1. Điều này chứng tỏ gen bar di truyền một cách ổn định từ thế hệ cây T0 sang cây T1.
3.4.2.2 Sự di truyền, phân ly của các đột biến gen GmGOLS ở thế hệ T1
Sự di truyền và phân ly của các đột biến tạo ra bởi CRISPR/Cas9 ở thế hệ T1 của các dòng M3.1 và M4.1 thuộc giống Mr cũng được nghiên cứu bằng cách điện di trên gel và giải trình tự (Hình 3.16). Ở thế hệ T0 kết quả ghi nhận từ Hình 3.14 cho thấy rằng các dòng M3.1 và M4.1 đều mang đột biến thể khảm (chimeric) ở hai
GmGOLS03 và GmGOLS19. Tuy nhiên, hầu hết các đột biến không được truyền sang thế hệ tiếp theo. Kết quả cụ thể về dạng phân ly và kiểu gen của các dòng đột biến thế hệ T1 được thống kê ở bảng 3.3.
Đối với GmGOLS03, chỉ một số alen nhất định xuất hiện ở cây T0 như dòng mất đoạn Δ-33 bp ở dòng M3.1 và mất đoạn Δ-30 bp của dòng M4.1 được di truyền, trong khi các alen mới cũng được quan sát thấy ở thế hệ T1. Ngoài ra, các alen đột biến mới của gen GmGOLS19 được phát hiện ở thế hệ T1 mà không quan sát thấy ở cây T0. Điều quan trọng là các alen đột biến mới mất đoạn Δ-30 bp xuất hiện ở dạng đồng hợp tử và hay mất đoạn Δ-22 bp và Δ-33 bp xuất hiện ở dạng biallelic ở thế hệ T1.
Bảng 3.3 Danh sách các dòng đậu tương mang đột biến gen GmGOLS03 và
GmGOLS19
Dòng đột biến
T1
Dạng đột biến (*) Kiểu gen (**)
Dạng phân ly ở thế hệ T2 (GmGOLS03// GmGOLS19) Kiểu gen ở thế hệ T2 (GmGOLS03// GmGOLS19)
GmGOLS03 GmGOLS19 GmGOLS03 GmGOLS19
M3.1-2
-22/-33 0 Biallelic WT -22//0 Homo//WT -33//0 Homo//WT -22/-33//0 Biallelic//WT
M3.1-6 -33 -22 Homo Homo -33/-22 Homo//Homo
M3.1-9
-22/-33 -22 Biallelic Homo -22//-22 Homo//Homo -33//-22 Homo//Homo -22/-33//-22 Biallelic//Homo M4.1-2 -30/0 0 Hetero WT -30//0 Homo//WT 0//0 WT//WT -30/0//0 Hetero//WT M4.1-4 -30 0 Homo WT -30//0 Homo//WT
M4.1-5 -30 -22 Homo Homo -30//-22 Homo//Homo
Ghi chú: (*) Dấu “-” thể hiện đột biến mất đoạn. (**) WT thể hiện gen quan tâm không đột biến, “Hetero” thể hiện sự đột biến xảy ra ở một alen của gen trong khi alen còn lại không đột biến, “homo” thể hiện sự đột biến xảy ra đồng thời ở hai alen và đột biến là giống nhau trên hai alen, và “biallelic” thể hiện 2 đột biến khác nhau xảy ra trên hai alen của một gen
3.4.2.3 Sự di truyền, phân ly của đột biến gen GmGOLS ở thế hệ T2
các đột biến định hướng, đặc biệt là các đột biến mất đoạn ngắn của gen quan tâm trong các dòng đậu tương ở các thế hệ tiếp theo, chúng tôi tiến hành xây dựng và sử dụng các chỉ thị phân tử là các mồi đặc hiệu với từng dạng đột biến. Sự di truyền của các alen GmGOLS đột biến ở thế hệ T2 từ các dòng T1 được đánh giá bằng các chỉ thị phân tử kết hợp với phương pháp điện di trên gel agarose và giải trình gen. Trong đó, chỉ thị GOLS-seg F được thiết kế đặc hiệu để nhận biết alen WT (tức là alen không đột biến) và alen đột biến mất 22 bp (Δ-22 bp); chỉ thị GOLS-seg F1 được thiết kế để nhận biết alen mang đột biến mất 33 bp (Δ-33 bp)và chỉ thị GOLS-seg F3 được thiết kế để nhận biết alen mang đột biến mất 30 bp (Δ-30 bp). Khi một trong các chỉ thị phân tử kết hợp với một mồi đặc hiệu cho gen GmGOLS03 hoặc GmGOLS19, thông qua phân tích sản phẩm PCR các alen được khuếch đại và xuất hiện băng vạch khi điện di trên gel agarose 2%.
Kết quả sàng lọc của các đột biến thông qua phân tích sản phẩm PCR sẽ thu được như dự kiến ban đầu tại Bảng 2.3.
Kết quả sàng lọc các đột biến bằng các chỉ thị phân tử như sau:
Chỉ thị phân tử GOLS-seq F: GOLS-seg F được thiết kế với mục tiêu kết hợp với mồi đặc hiệu G03R để phát hiện alen đột biến Δ-22 bp của gen GmGOLS03
(Bảng 2.3). Tuy nhiên, với thiết kế này kết quả PCR cũng sẽ khuếch đại được alen không đột biến (WT) của các dòng đậu tương nghiên cứu. Tương tự như vậy, khi kết hợp GOLS-seg F với mồi G19 R, các dòng mang alen đột biến Δ-22 bp và alen WT của gen GmGOLS19 sẽ thu được sản phẩm PCR đặc hiệu. Sử dụng cây T2 của 6 dòng T1 mang các dạng đột biến khác nhau (Bảng 3.3) để tiến hành phân tích với chỉ thị phân tử GOLS-seq F, chúng tôi thu được kết quả trên Hình 3.18. Đối với dòng M3.1-2, các cây T2 được kiểm tra đều cho một băng bạch DNA rõ nét (500 bp) khi sử dụng kết hợp GOLS-seq F cùng mồi đặc hiệu G03 R của gen
GmGOLS03 (Hình 3.18A). Điều này chứng tỏ các cây T2 của dòng M3.1-2 mang alen đột biến Δ-22 bp (ở dạng đồng hợp tử -22/-22 bp hoặc bialleilc -22/-33 bp) trên gen GmGOLS03. Trên gen GmGOLS19, sử dụng kết hợp GOLS-seq F cùng mồi đặc hiệu G19 R các cây T2 của dòng này đều có kết quả xuất hiện 1 băng vạch DNA, chứng tỏ sự có mặt của alen WT (Hình 3.18B).
Ở dòng M3.1-6, các cây T2 được kiểm tra đều không có sản phẩm PCR, chứng tỏ sự vắng mặt của alen Δ-22 bp và alen WT trên gen GmGOLS03 (Hình 3.18A).
Trên gen GmGOLS19, các cây T2 này đều xuất hiện băng vạch PCR đặc hiệu, điều này cho thấy sự di truyền của alen đột biến Δ-22 bp dạng đồng hợp tử (Hình 3.18B). Với dòng M3.1-9, các cây T2 đều có sự xuất hiện băng vạch DNA đặc hiệu, chứng tỏ chúng có mang alen đột biến mất -22 bp trên gen GmGOLS03 (Hình 3.18A). Tuy nhiên, tương tự như ở dòng M3.1-2, chỉ thị phân tử này cũng chưa chỉ ra được kiểu gen đồng hợp tử hoặc hoặc hai alen đột biến của gen GmGOLS03.
Trên gen GmGOLS19 các cây T2 được kiểm tra của dòng M3.1-9 đều có kết quả xuất hiện băng vạch thể hiện tính duy trì ổn định của alen đột biến mất Δ-22 bp ở dạng đồng hợp tử.
Hình 3.18. Kết quả phân tích sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử với các cây đột biến T2
A, C. Sản phẩm PCR khi kết hợp GOLS-seq F và mồi đặc hiệu G03 R; B,D. Sản phẩm PCR khi kết hợp GOLS-seq F và mồi đặc hiệu G19R; (-). Đối chứng âm sử dụng nước de-ion; (+). Đối chứng dương là DNA dòng cây không đột biến;
M. Thang DNA chuẩn 100 bp
Ngoài ra, các cây T2 của dòng M4.1-2 đều có xuất hiện băng vạch PCR đặc hiệu, cho thấy tính di truyền của alen WT của gen GmGOLS03 (Hình 3.18C). Trong khi đó, toàn bộ cây T2 của hai dòng M4.1-4 và M4.1-5 đều không thu được sản phẩm
PCR chứng tỏ sự vắng mặt của alen đột biến Δ-22 bp và alen WT của gen
GmGOLS03 ở các dòng cây này (Hình 3.18C). Tuy nhiên, toàn bộ cây T2 của cả 3 dòng M4.1-2, M4.1-4 và M4.1-5 đều cho thấy băng vạch PCR đặc hiệu cho gen
GmGOLS19 (Hình 3.18D). Điều này khẳng định sự mặt của alen đột biến Δ-22 bp hoặc alen WT của gen GmGOLS19 trên các dòng cây này.
Kết quả phân tích trên phù hợp với sự phân ly của kiểu gen đột biến đã được xác định ở thế hệ T1 (Bảng 3.3). Tuy nhiên, với chỉ thị phân tử GOLS-seg F chưa phân biệt các dòng mang đột biến đồng hợp tử alen Δ-22 bp và dạng hai alen (Biallelic) -22/-33 bp trên gen GmGOLS03. Thế nên, chỉ thị phân tử GOLS-seg F1 được phát triển để nhận dạng hai dạng đột biến này.
Chỉ thị phân tử GOLS-seg F1
GOLS-seg F1 là chỉ thị phân tử được thiết kế để nhận biết đặc hiệu alen đột biến mất Δ-33 bp trên gen GmGOLS03. Chỉ thị phân tử này được dùng để sàng lọc các alen đột biến mất Δ-33 bp ở các dòng M3.1-2, M3.1-9 và M3.1-6 thuộc thế hệ T2.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% với các cây T2 của các dòng lựa chọn được trình bày trên Hình 3.19. Trong đó, toàn bộ cây T2 của dòng M3.1-6 đều có băng vạch DNA đặc hiệu, chứng tỏ sự di truyền của alen đột biến Δ- 33 bp của gen GmGOLS03 ở dạng đồng hợp tử (Hình 3.19A).
Sự di truyền và phân ly của alen này ở dòng M3.1-2 cũng được thể hiện rõ (Hình 3.19B). Sản phẩm PCR của chỉ thị GOLS-seg F1 với mồi G03R không ghi nhận trên các cây T2 của dòng M3.1-2. Kết hợp với kết quả phân tích của chỉ thị phân tử GOLS-seq F, chúng tôi khẳng định toàn bộ các cây T2 của dòng M3.1-2 đều mang kiểu gen đồng hợp tử của alen đột biến Δ-22 bp. Với dòng M3.1-9, các cây T2 (3.1- 9-1 và 3.1-9-6) mang kiểu gen đồng hợp tử của alen đột biến Δ-22 bp. Trong khi đó dòng 3.1-9-5 mang kiểu gen hai alen -22/-33 (biallelic).
Như vậy, với việc sử dụng hai chỉ thị phân tử GOLS-seg F và GOLS-seg F1, kiểu gen của các dạng đột biến Δ -22 bp và dạng đột biến Δ-33 bp có thể được ghi nhận và sàng lọc một cách chính xác.
Hình 3.19. Kết quả phân tích sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử GOLS-seg F1 và GOLS-seg F3 với các cây đột biến T2
A, B. Sản phẩm PCR khi kết hợp GOLS-seq F1 và mồi đặc hiệu G03 R; C. Sản phẩm PCR khi kết hợp GOLS-seq F3 và mồi đặc hiệu G03 R; (-). Đối chứng âm sử dụng nước cất; (+). Đối chứng dương là DNA đã xác định mang alen -33bp ;
M. Thang DNA chuẩn 100 bp
Chỉ thị phân tử GOLS-seg F3
GOLS-seg F3 được thiết kế để nhận biết đặc hiệu alen đột biến Δ-30 bp của gen GmGOLS03. Các cây đậu tương đột biến T2 của các dòng cây M4.1-4 và M4.1- 5 được kiểm tra sàng lọc bằng kết hợp chỉ thị phân tử GOLS-seg F3 với mồi đặc hiệu G03 R, kết quả được thể hiện trên Hình 3.19 C. Toàn bộ các cây T2 được phân tích đều cho một băng vạch DNA đặc hiệu, trong khi cây WT không ghi nhận sản phẩm PCR trong Hình 3.19 C.
Kết quả này cho thấy tính đặc hiệu của chỉ thị này trong phân tích sự di truyền và phân ly của alen đột biến Δ-30 bp. Tổng hợp kết quả phân tích di truyền và phân ly của các alen đột biến sử dụng 3 chỉ thị phân tử như trên, chúng tôi ghi nhận được kiểu gen của các cây T2 thu được từ các dòng T1 có đặc điểm di truyền khác nhau (Bảng 3.4).
Kết quả phân tích cho thấy việc sử dụng kết hợp các chỉ thị phân tử này có thể chỉ ra được kiểu gen đồng hợp tử, biallelic của các alen đột biến đã ghi nhận ở thế hệ T1. Do số lượng mẫu phân tích chưa đủ lớn, tỉ lệ phân ly ở một số dòng cây T1 còn chưa thể hiện rõ như theo lý thuyết. Tuy nhiên, việc sử dụng thành công các chỉ thị phân tử này trong nhận diện từng alen đột biến riêng lẻ cũng như sự tồn tại của hai dạng alen đột biến khác nhau (biallelic) sẽ là cơ sở quan trọng trong sàng lọc và duy
trì các dòng đột biến với các tính trạng tiềm năng trong các thế hệ tiếp theo ở quy mô và số lượng mẫu lớn hơn.
Bảng 3.4 Tổng hợp kiểu gen của các dòng cây T2 sau khi sàng lọc với các chỉ thị phân tử
Cây đột biến T2 GmGOLS03Kiểu gen GmGOLS19
M3.1-2-1 Homo -22 WT M3.1-2-2 Homo -22 WT M3.1-2-5 Homo -22 WT M3.1-2-6 Homo -22 WT M3.1-6-1 Homo -33 Homo -22 M3.1-6-3 Homo -33 Homo -22 M3.1-6-4 Homo -33 Homo -22 M3.1-9-1 Homo -22 Homo -22 M3.1-9-5 Biallelic (-33, -22) Homo -22 M3.1-9-6 Homo -22 Homo -22 M4.1-2-3 WT WT M4.1-2-5 WT WT M4.1-2-8 WT WT M4.1-4-2 Homo -30 WT M4.1-4-4 Homo -30 WT M4.1-5-2 Homo -30 Homo-22 M4.1-5-5 Homo -30 Homo-22
Ghi chú: Homo. Kiểu gen đồng hợp tử; Biallelic. Hai alen đột biến khác nhau; WT. Alen không đột biến
Nhằm kiểm tra khả năng phân biệt chính xác các dạng đột biến gen GmGOLS
với các chỉ thị phân tử đã được phát triển, chúng tôi lựa chọn một số dòng cây và tiến hành giải trình tự vùng DNA mang đột biến của hai gen GmGOLS03 và
GmGOLS19, kết quả giải trình tự thể hiện ở Hình 3.20.
Kết quả giải trình tự trên hoàn toàn phù hợp với kết quả PCR và điện di trên gel agarose của các chỉ thị phân tử. Trong đó, các cây T2 của dòng M3.1-2 đều mang kiểu gen đồng hợp tử của alen đột biến -22 bp trên gen GmGOLS03. Các dòng cây T2 của dòng M4.1-4 và M4.1-5 mang alen đột biến Δ-30 bp trên gen
GmGOLS03 ở dạng đồng hợp tử (Hình 3.20A). Với gen GmGOLS19, hai cây T2 thuộc dòng M4.1- 4 ghi nhận alen WT, trong khi alen đột biến Δ-22 bp xuất hiện ở dạng đồng hợp tử
trên các cây T2 được kiểm tra của dòng M4.1-5 (Hình 3.20B).
Hình 3.20. Kết quả giải trình tự vùng gen đột biến trên các cây T2 từ dòng 3.1 và 4.1 của thế hệ T0 giống Mr
A. Trình tự vùng đột biến trên gen GmGOLS03; B. Trình tự vùng đột biến trên gen GmGOLS19; Target 1(vùng tô vàng) và Target 2(vùng tô xanh): trình tự định hướng tạo đổi biến bởi hệ thống CRISPR/Cas9; ∆: dạng đột biến; genotype: kiểu
gen của các cây đột biến; Homo: kiểu gen đồng hợp tử; WT: kiểu gen không đột biến
Giống đậu tương Mr được sử dụng như giống mô hình để kiểm chứng quy trình chuyển gen và hoạt động của cấu trúc vector chỉnh sửa gen cũng như phát triển hệ thống chỉ thị phân tử trong sàng lọc các đột biến mất đoạn có kích thước nhỏ. Tuy nhiên, yêu cầu về điều kiện sinh thái cũng như khả năng sinh trưởng của giống đậu tương này không phù hợp tốt với điều kiện canh tác đậu tương ở phía Bắc Việt Nam. Do vậy, để đảm bảo tính hiệu quả và tính chính xác trong việc đánh giá ảnh hưởng của đột biến định hướng trên gen GmGOLS tới sinh trưởng, phát triển và thành phần hạt đậu tương, chúng tôi lựa chọn các dòng đậu tương đột biến có nguồn gốc từ giống
ĐT26 sử dụng cho các phân tích nông sinh học tiếp theo.