4. Những đóng góp mới của luận án
2.3.6 Phương pháp trồng và chăm sóc cây đậu tương trong điều kiện nhà
Cây đậu tương được trồng trong các chậu nhựa (chiều cao 25 cm, đường kính 20 cm) chứa hỗn hợp TRiBAT (Công ty TNHH MTV Sài Gòn xanh, Việt Nam) và trồng trong điều kiện nhà kính ở 28-35°C với quang chu kỳ 16 giờ sáng/8 giờ tối. Cây đậu tương được bón phân hai lần với NPK (15:5:20) sau khi trồng 40 ngày và NPK (16:16:16) sau khi trồng 65 ngày. Hạt đậu tương được thu hoạch và bảo quản trong kho lạnh (độ ẩm 40%, 4oC) cho các thí nghiệm tiếp theo. Các chỉ số sinh trưởng bao gồm chiều cao cây (cm), số nhánh, số lóng của mỗi cây được ghi lại khi cây ở giai đoạn trưởng thành (giai đoạn R8). Chiều dài lá và chiều rộng lá (cm) được đo tại các vị trí lá khác nhau ở giai đoạn phát triển R2 của cây
2.3.7 Phân tích sự di truyền của đột biến định hướng và gen chuyển các dòng đậu tương chỉnh sửa gen
Kiểm tra sự tính kháng thuốc trừ cỏ của dòng đột biến
Các dòng đậu tương T0, T1, T2 được kiểm tra sự có mặt của gen chọn lọc
bar thông qua phương pháp phết thuốc trừ cỏ như mục 3.2.5. Lá của các dòng đậu tương chuyển gen ở các thế hệ khác nhau được sử dụng để tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB của Doyle và cộng sự (1991) và được sử dụng cho các phân tích tiếp theo.
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển
Các dòng đậu tương T1, T2 được kiểm tra sự có mặt của gen chuyển thông qua phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen pcoCas9 và gen bar (Bảng phụ lục 1), với 35 chu kỳ khuếch đại. Sản phẩm PCR của các dòng đột biến được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển.
Kiểm tra sự di truyền và phân ly của các đột biến trên các dòng đậu tương chỉnh sửa gen
DNA của các dòng đột biến thế hệ T1, T2 được sử dụng cho phân tích biến tính hồi tính trên gel polyacrylamide 15% theo phương pháp của Zhou và cộng sự (2014) [96] như trình bày ở mục 2.3.4. Sản phẩm PCR cũng được tinh sạch, tách dòng trong vector pJET1.2 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) và giải trình tự bằng hệ thống ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer tại tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Xây dựng các chỉ thị phân tử để phát hiện các đột biến mất đoạn có kích thước nhỏ ở thế hệ T2 giống Maverick
Các chỉ thị phân tử được sử dụng cho việc sàng lọc và kiểm tra sự di truyền của các dòng đột biến phân ở thế hệ T2, xây dựng dựa trên nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn DNA như Hình 2.2A, đồng thời kết hợp với kết quả giải trình tự của đột biến các gen GmGOLS ở thế hệ T1 của giống Maverick theo phương pháp của Đỗ Tiến Phát và cộng sự (2019) [87].
Hình 2.2. Sơ đồ minh họa nguyên lý thiết kế các chỉ thị phân tử dùng trong sàng lọc đột biến phân ly
A. Minh hoạ các chỉ thị phân tử bám được vào trình tự gen và không bám được vào trình tự gen do đột biến; B.Minh họa sản phẩm PCR trên bản gel agarose, ô màu thể hiện sự xuất hiện băng vạch trên bản gel, và ô nét đứt thể hiện sự không xuất
Kí hiệu và trình tự các chỉ thị phân tử như sau:
GOLS-seg F (5’-TGGAGTCACACCCCTCAGTA-3’), Tm: 560C; GOLS-seg F1 (5’-AGACATGGAGTCACACCCCG-3’), Tm: 600C; GOLS-seg F3 (5’-AGACATGGAGTCACACATGC-3’), Tm: 560C.
Khi kết hợp các chỉ thị phân tử này với các mồi đặc hiệu cho gen GmGOLS
G03R (5’- CCCCGTATATCTCCATGGCTTGG-3’); Tm: 560C G19R (5’- GCGCCAGAGCATGGCAAGGAC-3’); Tm: 560C
Trong đó, GOLS-seg F được thiết kế đặc hiệu để nhận biết alen WT (tức là alen không đột biến) và alen đột biến mất 22 bp (Δ-22 bp); GOLS-seg F1 được thiết kế để nhận biết alen mang đột biến Δ-33 bp; và GOLS-seg F3 được thiết kế để nhận biết alen mang đột biến Δ-30 bp. Khi chỉ thị phân tử kết hợp với một mồi đặc hiệu cho gen GmGOLS03 hoặc GmGOLS19, thông qua PCR, các alen được khuếch đại và xuất hiện băng vạch khi điện di trên gel agarose (Hình 2.2 B).
Bảng 2.3. Dự kiến khả năng phát hiện các alen đột biến thông qua phản ứng PCR sử dụng các chỉ thị phân tử Dạng đột biến Chỉ thị phân tử GmGOLS03 GmGOLS19 -22 -33 -22/-33 -30 WT -22 WT GOLS-seg F + G03 R (Tm: 560C) + + + GOLS-seg F + G19 R (Tm: 560C) + + GOLS-seg F1 + G03 R (Tm: 600C) + + + GOLS-seg F1 + G19 R (Tm: 600C) GOLS-seg F3 + G03 R (Tm: 560C) + +
Ghi chú: (+) Kết quả dương tính với phản ứng PCR; WT. Alen không mang đột biến
Phương thức tiến hành như sau: từ các mẫu DNA của dòng đậu tương mang gen đột biến thế hệ T2, vùng gen GmGOLS03 và GmGOLS19 được khuếch đại bằng các chỉ thị phân tử với thành phần phản ứng bao gồm: 7,5µl DreamTaq green mastermix 2X (Thermo Scientific, Mỹ), 5 pM mồi xuôi, 5 pM mồi ngược, 100 ng DNA và 6,5 µl deion -H2O (đã khử DNAse và RNAse). Chu trình khuếch đại được thực hiện như sau: biến tính khởi đầu ở 94ºC trong 3 phút, khuếch đại trong 35 chu kỳ theo các bước lần lượt sau (1) biến tính ở 94ºC trong 30 giây, gắn mồi ở Tm (nhiệt độ gắn mồi) tùy thuộc chỉ thị phân tử trong 30 giây, (2) kéo dài ở 72ºC trong 30 giây,
(3) kéo dài kết thúc ở 72ºC trong 7 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2 %, các băng vạch DNA xuất hiện sẽ được dùng trong đánh giá sự di truyền của đột biến và hiệu quả của các chỉ thị phân tử.
Kết hợp kết quả xác định trình tự đột biến các gen GmGOLS ở thế hệ cây T1 và kết quả di truyền và phân ly của các đột biến thông qua phân tích PCR dự đoán sẽ thu được như Bảng 3.4.