4. Những đóng góp mới của luận án
3.3.1 Tạo cây đậu tương chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens
Giống đậu tương ĐT26 được trồng phổ biến, có khả năng kháng bệnh gỉ sắt, đốm nâu và khả năng chịu ruồi đục thân, chống đổ khá, năng suất cao được đánh giá là giống ưu tú của Việt Nam, là đối tượng nghiên cứu được chọn để tạo cây đậu tương đột biến nhằm tăng chất lượng hạt, ứng dụng trong công tác phát triển giống mới. Giống đậu tương Mr được sử dụng như giống cây mô hình cho quy trình chuyển gen. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 mang vector pFGC5941/G03-19 được sử dụng để chuyển gen vào đậu tương thông qua nốt lá mầm hạt trưởng thành của hai giống đậu tương ĐT26 và Mr theo phương pháp đã được tối ưu của Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện CNSH [87] [90].
Với tổng lượng mẫu biến nạp là 1082, sau 2 lần chọn lọc liên tiếp ở giai đoạn cảm ứng tạo chồi với nồng độ glufosinate 6 mg/l và 3 lần chọn lọc ở giai đoạn kéo dài chồi với nồng độ glufosinate 3 mg/l đã thu được 14 chồi kéo dài với giống ĐT26 và 14 chồi với giống Mr, các chồi đạt chiều cao 2,5–3,5 cm và có các lá chính được cắt sang môi trường tạo rễ. Sau 7-10 ngày, các chồi có bộ rễ hoàn chỉnh được trồng trên giá thể TN1 bổ sung 25% TRiBAT.
Sau quá trình thích nghi sinh trưởng trong buồng sinh trưởng nhiệt độ 28oC, độ ẩm 80%, quang chu kỳ 16 giờ sáng/8 giờ tối, đã thu được tổng số 16 cây đậu tương hoàn chỉnh ngoài giá thể của hai giống nghiên cứu. Kết quả chuyển gen vào đậu tương
được trình bày ở Hình 3.12 và Bảng 3.2.
Hình 3.12. Minh họa quá trình chuyển gen vào đậu tương thông qua nốt lá mầm
A. Mảnh lá mầm đồng nuôi cấy 5 ngày, B. Mảnh lá mầm sau 14 ngày chọn lọc, C. Mảnh lá mầm sau 28 ngày chọn lọc, D. Chồi kéo dài trên môi trường chọn lọc,
E. Lá cây DT 1.1 (+) với ppt 200 mg/l, F. Lá cây ĐT26 (-) với ppt 200 mg/l, G. Cây chuyển gen 25 ngày tuổi
Bảng 3.2. Kết quả chuyển gen của giống ĐT26 và Mr
Giống đậu tương Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo đa chồi Số chồi kéo dài Số chồi tạo rễ Số cây sống trên giá thể ĐT26 606 300 14 8 8 Mr 476 289 14 8 8