4. Những đóng góp mới của luận án
2.3.1 Thiết kế vector chuyển gen mang hệ thống CRISPR/Cas9
- Phân tích thông tin về trình tự và biểu hiện gen Galactinol synthase: Dựa trên các nghiên cứu trước đây kết hợp với nguồn dữ liệu mở trên NCBI, Phytozome và SoyKB, trình tự hai gen mã hóa cho enzyme galactinol synthase có mức độ biểu hiện cao trên hạt đậu tương đã được xác định. Sử dụng chương trình tin sinh học (CRISPR- PLANT) và (CRISPR Design Tool), kết hợp với trình tự gen đã được lựa chọn để xác định trình tự định hướng (sgRNAs) theo phương pháp của Vibha Srivastava và cộng sự (2017) [86]. Từ 2-3 trình tự định hướng tối ưu với độ tương đồng cao về trình tự ở trên hai gen quan tâm sẽ được thiết kế. Khung vector chuyển gen thực vật chứa gen Cas9 nhận được từ nguồn Addgene.
Galactinol synthase và promoter U6 (Arabidopsis U6 promoter) được kết nối sử dụng hệ thống cloning vector (NEB® Golden Gate Assembly Kit -BsaI- HF®v2).
- Các cấu trúc mang trình tự định hướng và promoter U6 được ghép nối vào vector chuyển gen pFGC-Cas9 sử dụng hệ thống pFGC-Cas9-gateway được cung cấp bởi phòng thí nghiệm của giáo sư Stacey, đại học Missouri, Mỹ [87]. Cụ thể như sau: Bước 1: Ghép nối phân đoạn gen biểu hiện Cas9 (35S promoter-Cas9- Nos terminator) từ vector HBT-proCas9 sang vector đích pFGC5941 (-) thông qua các phản ứng cắt và nối ghép gen tại vị trí các enzyme cắt hạn chế XhoI và EcoRI, tạo thành vector pFGC5941(-)/Cas9
Bước 2: PCR khuếch đại các phân đoạn phiên mã các gRNAs bao gồm: PstI/U6 promoter-gRNA1-gRNA scaffold/EcoRI và EcoRI/U6 promoter- gRNA2-gRNA scaffold/PstI bằng phản ứng overlap PCR sử dụng khuôn là vector pBlu-gRNA và các cặp mồi như đã nêu trong bảng phụ lục 1.
Bước 3: Nối ghép đồng thời 2 phân đoạn phiên mã 2 gRNA vào vector pFGC5941(-)/Cas9 tạo thành vector hoàn chỉnh pFGC5941(-)
/Cas9/gRNA1/gRNA2.
+ Xử lý vector pFGC5941(-)/Cas9 bằng PstI.
+ Xử lý đồng thời 2 phân đoạn PstI/U6 promoter-gRNA1-gRNA scaffold/EcoRI và EcoRI/U6 promoter-gRNA2-gRNA scaffold/PstI bằng cặp enzyme hạn chế PstI và EcoRI.
+ Tiến hành phản ứng ligation dưới xúc tác của enzyme T4-DNA ligase nối ghép đồng thời vector pFGC5941(-)/Cas9 đã được mở vòng và 2 phân đoạn gRNA đã xử lý enzyme cắt hạn chế.
Sơ đồ thiết kế của vector chuyển gen hoàn chỉnh được mô phỏng như Hình 3.4. - Vector chỉnh sửa gen sau khi được hoàn thiện sẽ được chuyển vào chủng vi khuẩn A. rhizogenes và A. tumefaciens AGL1 do phòng Công nghệ tế bào thực vật cung cấp bằng phương pháp sốc nhiệt của David Neece (2013).