4. Những đóng góp mới của luận án
3.5.3 Phân tích thành phần của hạt của các dòng đậu tương mang đột biến
3.5.3.1 Phân tích các RFOs có trong hạt của các dòng đậu tương mang đột biến
Các nghiên cứu trước đây cho thấy GOLS là enzyme đầu tiên và đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa galactosyl liên quan đến việc chuyển hóa RFOs và quá trình sinh tổng hợp RFOs ở 20 loài thực vật. Enzyme này chịu sự điều phối của nhóm gen mã hoá GmGOLS [36]. Trên đậu tương có 6 gen mã hóa cho GOLS, trong đó Glyma.03G222000 (GmGOLS03) và Glyma.19G219100
(GmGOLS19 )có biểu hiện mạnh nhất trong quá trình phát triển của hạt (Hình 3.1). Bên cạnh đó, nồng độ RFOs chiếm hơn 50% tổng lượng đường hòa tan có trong hạt đậu tương [9]. Trong nghiên cứu này, bằng kỹ thuật CRISPR/Cas9 đã gây đột biến mất chức năng gen GmGOLS03 và gen tương đồng GmGOLS19, có biểu hiện mạnh nhất trong việc mã hóa cho GOLS. Để đánh giá sự tác động của hai gen này ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp nhóm đường RFOs, các thành phần có trong hạt trưởng thành của các dòng đậu tương mang đột biến tiềm năng được tiến hành phân tích.
Kết quả phân tích về thành phần cacbohydrat hòa tan, RFOs tổng số và hàm lượng của các thành phần RFOs (Hình 3.24 và 3.25) có trong hạt các dòng đột biến bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ cho thấy:
So với hạt đối chứng, hạt của các dòng đột biến được kiểm tra đều có lượng đường RFOs và tổng hàm lượng carbohydrate hòa tan thấp hơn. Sự sụt giảm tổng lượng cacbohydrat hòa tan chủ yếu là do giảm stachyose và sucrose, hai thành phần chiếm 90% tổng lượng cacbohydrat hòa tan được định lượng trong hạt đối chứng.
Hàm lượng stachyose trong hạt của các dòng đột biến đơn gen giảm 41,4% xuống còn 34,86 mg/g khối lượng khô (p < 0,001) và giảm 35,4% xuống còn 38,46 mg/g khối lượng khô ở các dòng đột biến hai gen (p < 0,001) so với ở hạt đối chứng (59,5 mg/g). Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hàm lượng stachyose giữa các dòng đột biến đơn gen và hai gen (p = 0,0679).
Hàm lượng sucrose ở hạt của các dòng đột biến đơn gen cũng giảm 25,4% xuống còn 37,4 mg/g khối lượng khô (p < 0,001). Tuy nhiên, ở các dòng đột biến hai gen không ghi nhận được sự thay đổi có ý nghĩa (giảm 9,4% xuống còn 45,4 mg/g, p= 0,1) so với hạt của dòng đối chứng (50,1 mg/g). Hàm lượng các đường thành phần của RFOs cũng ghi nhận được sự khác biệt đáng kể so với dòng đối chứng. Tất cả các dòng đột biến được thử nghiệm đều thể hiện sự tích lũy raffinose tăng lên, trung
bình cao hơn 47,44% ở đột biến đơn (p = 0,0254) và 41,7% ở đột biến kép (p = 0,0472).
Tuy nhiên, hàm lượng raffinose của các dòng đột biến đơn và đột biến kép không khác biệt về mặt thống kê (p = 0,24). Hơn nữa, hàm lượng verbascose giảm 22,6% (ở hạt đột biến đơn) và 42,1% (ở hạt đột biến kép) so với đối chứng.
Hình 3.24. Tổng số cacbohydrat hòa tan và tổng số RFOs được đo bằng HPLC
(ĐT26 là hạt giống đối chứng; D1.1-7-2, D1.1-14-3 là hạt từ cây T2 đột biến đơn gen GmGOLS03; D1.1-5-4, D1.1-7-1 là hạt từ cây T2 đột biến hai gen GmGOLS03 GmGOLS19. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (one-way ANOVA). Các chữ cái khác
nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05. Giá trị trung bình ± SD được hiển thị cho n = 4)
Tổng hàm lượng RFOs, được đo bằng tổng của raffinose, stachyose và verbascose là 64,7 mg/g khối lượng khô ở hạt đối chứng, đã giảm 30,2% xuống 45,13 mg/g ở thể đột biến đơn và 34,1% xuống 41,95 mg/g ở đột biến kép. Trong khi đó, không tìm thấy sự thay đổi đáng kể về hàm lượng glucose hoặc fructose giữa hạt đối chứng và hạt đột biến (p > 0,05).
Hình 3.25. Thành phần carbohydrate trong hạt đậu tương
(A). Carbohydrate chiếm lượng lớn là stachyose và sucrose. (B) các carbohydrate lượng nhỏ hơn.
ĐT26 là hạt giống đối chứng; D1.1-7-2, D1.1-14-3 là hạt từ cây T2 đột biến đơn gen GmGOLS03; D1.1-5-4, D1.1-7-1 là hạt từ cây T2 đột biến hai gen GmGOLS03 GmGOLS19. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng
phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (one-way ANOVA). Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05.Giá trị trung bình ± SD được
Hình 3.26. Tỉ lệ carbohydrate dạng stachyose và sucrose trên tổng khối lượng carbohydrate hòa tan trong hạt đậu tương
ĐT26 là hạt giống đối chứng; D1.1-7-2, D1.1-14-3 là hạt từ cây T2 đột biến đơn gen GmGOLS03; D1.1-5-4, D1.1-7-1 là hạt từ cây T2 đột biến hai gen
GmGOLS03 GmGOLS19. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (one-way ANOVA). Các chữ cái khác
nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05. Giá trị trung bình ± SD được hiển thị cho n = 4.
Điều đặc biệt là các dạng carbohydrate riêng lẻ được tính theo tỉ lệ phần trăm với carbohydrate hòa tan tổng số (Hình 3.26), dễ thấy là tỉ lệ tương đối của sucrose thực sự tăng lên ở cả đột biến đơn và kép so với đối chứng. Ngoài ra, tỉ lệ stachyose ở cây đột biến kép và đơn thấp hơn so với cây đối chứng.
3.5.3.2 Phân tích các thành phần khác có trong hạt của các dòng đậu tương mang đột biến
Tiến hành phân tích định lượng các thành phần khác của hạt bao gồm độ ẩm, protein, chất béo và tinh bột (Hình 3.27, Bảng 3.5).
Bảng 3.5 Các thành phần khác trong hạt đậu
Protein (%) Chất béo (%) Tinh bột (%)
WT (ĐT26) 38,30 ± 0,49 a 19,83 ± 1,28 a 5,090 ± 0,84 a
D1.1-7-2 40,06 ± 1,09 b 22,88 ± 0,52 b 5,770 ± 1,00 a
D1.1-14-3 40,06 ± 0,54 b 20,92 ± 0,69 a 4,775 ± 0,38 a
D1.1-5-4 38,28 ± 0,49 a 20,37 ± 1,45 a 5,509 ± 1,29 a
D1.1-7-1 38,68 ± 0,53 a 20,52 ± 0,79 a 5,219 ± 1,19 a
Ghi chú: Hạt WT (wild type) là giống ĐT26 không mang đột biến; D1.1-7-2, D1.1-14-3 là tên các dòng đậu tương T2 đột biến đơn gen GmGOLS03; D1.1-5-4, D1.1-7-1 là tên các dòng đậu tương T2 đột biến đồng thời hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19 double mutants. Số liệu được phân tích thống kê phương sai ANOVA và kiểm định hậu định bằng kiểm định Tukey ở mức ý nghĩa p=0,05.
Hình 3.27. Tỉ lệ các thành phần khác trong hạt đậu tương
ĐT26: hạt dòng đối chứng; DT1.1-7-2, DT1.1-14-3: hạt các dòng T2 mang đột biến đơn gen GmGOLS03; DT1.1-5-4, DT1.1-7-1: hạt các dòng T2 mang đột biến
hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19
Kết quả phân tích không có sự khác biệt đáng kể về thành phần tinh bột trong hạt giữa hạt đột biến được kiểm tra và hạt đối chứng. Tuy nhiên, hạt từ các dòng đột
Tinh bột Độ ẩm Chất béo Protein
biến đơn GmGOLS03 có hàm lượng protein tăng (40,06% so với 38,30% của đối chứng, p = 0,00254) và hàm lượng chất béo tăng (21,9% so với 19,8% của đối chứng, p = 0,0201), trong khi ở các dòng đột biến kép GmGOLS03 và GmGOLS19
không có sự thay đổi đáng kể nào (p = 0,581 và 0,406 lần lượt đối với chất đạm và chất béo).
Kết quả này cho thấy chức năng của GmGOLS03 và GmGOLS19 không chỉ giới hạn trong quá trình sinh tổng hợp RFOs mà nó còn có thể liên quan đến quá trình sinh tổng hợp của một số thành phần khác có trong hạt đậu tương và các nghiên cứu sâu hơn cần được thực hiện để làm rõ kết luận này.