Hiện nay các nghiêu cứu để tách chiết collagen hầu hết là xử lý phi collagen bằng dung dịch kiềm loãng, thông dụng nhất vẫn là NaOH.
NaOH, Ca(OH)2 và Na2CO3 thường được sử dụng trong quá trình tiền xử lý của quá trình trích ly collagen, nhưngNaOH được sử dụng thông dụng nhất. Đặc biệt trên nguyên liệu là da, NaOH là tác nhân gây trương nở đáng kể, tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết xuất collagen, thể hiện qua tốc độ thấm vào các mô nhanh hơn (Liu và ctv, 2015). Mặt khác, dung dịch NaOH có khả năng khử các hợp chất nitơ phi- protein, trong khi collagen có tính lưỡng tính nên chịu được tác động của NaOH. Hầu hết các nghiên cứu hiện nay đều sử dụng dung dịch NaOH để loại bỏ lipid, khoáng
và các protein không phải là collagen cho nguyên liệu là da cá. Tuy nhiên, tùy thuộc vào thành phần hóa học và tính chất của các loại da cá khác nhau để có thể chọn nồng độ NaOH, thời gian ngâm và tỷ lệ dung dịch NaOH/da cá ở các mức tỷ lệ khác nhau. Ngoài ra, đối với các loại nguyên liệu có thành phần lipid cao thì có thể kết hợp xử lý bằng NaOH với các dung môi như alcohol, n-hexan để loại bỏ chất béo (Liu và ctv, 2015; Pal và ctv, 2015; Wang và ctv, 2017).
Cụ thể, để loại bỏ thành phần phi collagen trên da cá ngừ mắt to, da cá được ngâm trong dung dịch NaOH 0,05 – 0,1N với tỷ lệ da cá/ dung dịch là 1:10 (w/v), khuấy liên tục trong 6 giờ và cứ 2 giờ thay dung dịch NaOH một lần, sau đó rửa bằng nước đến pH trung tính rồi tiếp tục ngâm trong dung dịch butyric 100 g/lít với tỷ lệ da cá/ dung dịch butyric là 1:10 (w/v) trong 18 giờ, cứ 6 giờ thay dung dịch butyric một lần (Benjakul và ctv, 2010). Đối với da của bốn loài cá olive flounder (Paralichthys olivaceus), black rockfish (Sebastes schlegeli), sea bass (Lateolabrax maculatus), and red sea bream (Pagrus major) thì thành phần phi collagen được loại bỏ bằng cách ngâm vào dung dịch NaOH 0,1N trong 24 giờ, khuấy liên tục ở nhiệt độ 5 C (Cho và ctv, 2014). Thành phần phi collagen trên da cá rô phi được loại bỏ bằng cách ngâm trong dung dịch NaOH 0,05N với tỷ lệ da cá/ dung dịch NaOH là 1:10 (w/v) trong 6 giờ (Thuanthong và ctv, 2016).
Đối với cá trắm cỏ, để loại bỏ protein không phải collagen và sắc tố thì vảy, da, bong bóng được ngâm trong 20 thể tích của NaOH 0,1M trong 36 giờ, thay dung dịch kiềm sau mỗi 12 giờ, sau đó được rửa sạch với nước cất lạnh. Vảy sẽ được khử canxi với 10 thể tích của EDTA 0,5M trong 72 giờ, thay dung dịch sau mỗi 24 giờ. Trong khi đó da và bong bóng sẽ được cho vào 20 thể tích butyl alcohol 10% (v/w) trong 24 giờ để loại bỏ chất béo, thay dung dịch mỗi 12 giờ, sau đó rửa sạch với nước cất lạnh (Liu và ctv, 2015). Theo Cho, Gu, and Kim, 2005 điều kiện tối tư để xử lý da cá ngừ vây vàng ở Hàn Quốc là NaOH 1,89%, thời gian xử lý 2,87 ngày, tỷ lệ dung dịch ngâm là 8:1 (v/w), nhiệt độ ngâm 10 C, sau đó trích ly gelatin bằng nước ở nhiệt độ 58,15 C. Tuy nhiên, theo Woo và ctv (2008) điều kiện tối ưu để xử lý da cá ngừ vây vàng cũng ở Hàn Quốc là NaOH 0,92 N, thời gian xử lý là 24 giờ, tỷ lệ
dung dịch ngâm là 5:1 (v/w) và nhiệt độ ngâm là 9 C. Theo Liu, Wei và ctv (2015) thì nồng độ NaOH và nhiệt độ xử lý da cá nếu không phù hợp sẽ làm mất lượng collagen trên da cá một cách đáng kể.
Zhong Rui và ctv (2013) đã xử lý da cá thu bằng cách ngâm với NaOH 0,1 M ở tỷ lệ dung dịch kiềm/da là 10/1 (v/w) trong 2 ngày ở 4 C, thay đổi dung dịch kiềm sau mỗi 6 giờ, khử mỡ với butylic 10% với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 (w/v) trong 2 ngày, dung môi được thay đổi sau mỗi 6 giờ, sau rửa sạch bằng nước lạnh.
Theo Phanat và ctv (2010), da cá mập được xử lý với NaOH 0,1 M để loại bỏ protein phi collagen với tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch kiềm là 1/10 (w/v). Sau đó, da được rửa bằng nước lạnh cho đến khi đạt độ pH trung tính để loại hết lipid thừa. Theo Min và ctv (2009), da của cá phổi (lungfish) được ngâm trong NaOH 0,1 M chứa 0,5% chất tẩy không ion trong 24 giờ ở 4 C sau đó được rửa trung tính bằng nước cất. Chất béo dư được loại bỏ trong butylic 15% (v/v) với tỷ lệ mẫu/dung dịch là 1/20 (w/v) trong 24 giờ với sự thay đổi dung dịch mỗi 12 giờ. Da đã khử chất béo được rửa kỹ bằng nước cất. Để loại bỏ sắc tố hiệu quả hơn, da sau khi khử mỡ được tẩy trắng bằng dung dịch H2O2 3% trong 24 giờ.
Trong nghiên cứ của Jin-Wook và ctv (2008), da cá được xử lý với dung dịch kiềm (NaOH 0,5 – 1,3N), tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/5 (w/v) ở 9 C, lắc ở 200 vòng/phút trong 12 – 36 giờ, trung hòa với HCl 6N và rửa sạch. Da cá hồng mắt to được Sitthipong Nalinanon và ctv (2007) xử lý tạp chất phi collagen bằng cách ngâm với dung dịch NaOH ở nồng độ 0,1M với tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10 (w/v) ngâm liên tục trong 6 giờ và đổi dung dịch mỗi lần sau 2 giờ. Da được rửa đến trung tính, sau đó được loại lipid bằng rượu butyl 10% với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10 (w/v) trong 18 giờ và dung môi được thay đổi sau 6 giờ.
Ahmed và Chun (2017) đã loại béo trong da cá ngừ bằng cách dùng CO2 siêu tới hạn ở 40 C và 250 bar trước khi chiết xuất collagen bằng pepsin. Ngoài ra, Trần Kiều Anh và ctv (2017) đã tách lipid trong phụ phẩm từ da cá hồi bằng 2 phương pháp tách bằng dung môi và bằng gia nhiệt. Kết quả cho thấy, phương pháptách chiết bằng dung môi cho hiệu suất cao hơn 10% so với tách bằng nhiệt. Điều này có thể
giải thích do trong điều kiện nhiệt độ cao (95 C) sẽ khiến các protein bị phá vỡ cấu trúc cuộn xoắn khiến các phân tử lipid bị mắc kẹt lại, giảm khả năng giải phóng ra ngoài.
Trên đây là một số phương pháp và điều kiện xử lý để loại bỏ phần phi collagen trên da cá. Hầu hết các nghiên cứu về tách chiết collagen, để loại bỏ phi collagen trên nguyên liệu đều sử dụng dung dịch NaOH. Mỗi loại nguyên liệu khác nhau thì điều kiện xử lý như nồng độ NaOH, tỷ lệ dung dịch NaOH/nguyên liệu (v/w) và thời gian ngâm khác nhau. Tuy nhiên, các tác giả không đưa ra tỷ lệ phần phi collagen đã loại bỏ mà chỉ chú ý đến các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm thu được và hiệu quả thu hồi sản phẩm. Như vậy đối với mỗi loại nguyên liệu khác nhau thì cần nghiên cứu điều kiện tối ưu để loại bỏ phi collagen.