Dựa vào tổng quan tài liệu thời gian để xử lý phi collagen trên da cá ngừ vây vàng bằng NaOH được chọn trong phạm vi từ 19 giờ – 33 giờ. Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được thực hiện ở các thời gian ngâm NaOH lần lượt là 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 và 33 giờ. Các yếu tố cố định là: tỷ lệ dung dịch NaOH/da cá 10/1 (v/w), nhiệt độ ngâm là 4 C và nồng độ NaOH (được xác định ở mục 2.2.1.2). Khối lượng da cá trong mỗi mẫu thí nghiệm là 5 g. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Tỷ lệ hyp/protein (%) lớn nhất và hàm lượng lipid (%) tính theo chất khô là nhỏ nhất.
2.3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch NaOH/nguyên liệu
Dựa vào tổng quan tài liệu tỷ lệ dung dịch NaOH/da cá (v/w) để xử lý phi collagen trên da cá ngừ vây vàng được chọn trong phạm vi từ 2/1 – 10/1. Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được thực hiện với tỷ lệ dung dịch NaOH/da cá (v/w) lần lượt là: 2/1; 3/1; 4/1; 5/1; 6/1; 7/1; 8/1; 9/1 và 10/1. Các yếu tố cố định là: nồng độ NaOH (được xác định ở mục 2.2.1.2), thời gian ngâm NaOH (được xác định ở mục 2.2.1.3) và nhiệt độ ngâm là 4 C. Khối lượng da cá trong mỗi mẫu thí nghiệm là 5 g. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Tỷ lệ hyp/protein (%) lớn nhất và hàm lượng lipid (%) tính theo chất khô là nhỏ nhất.
2.3.1.5. Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa quá trình xử lý NaOH
Thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện xử lý phi collagen trên da cá ngừ vây vàng bằng NaOH được thiết kế thí nghiệm theo phương pháp bề mặt đáp ứng (response surface methodology) (Box- Belnken,1960) với 3 lần thí nghiệm lặp lại tại điểm tâm và sử dụng phần mềm JMP để bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu. Các biến độc lập là:
nồng độ NaOH (X1, N); thời gian xử lý (X2, h); tỷ lệ dung dịch NaOH/ da cá (X3, v/w) và yếu tố cố định là nhiệt độ xử lý 4 C. Với biến phụ thuộc là tỷ lệ Hydroxyproline/protein (Y1, %); hàm lượng chất béo còn lại so với chất khô (Y2, %). Phạm vi và giá trị tại tâm của các biến độc lập được bố trí theo (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Bảng giá trị mã hóa của biến độc lập
Biến độc lập Ký hiệu Phạm vi giá trị các biến
-1 0 1 Nồng độ NaOH (N) Thời gian xử lý (h) Tỉ lệ thể tích NaOH/ da cá (v/w) X1 X2 X3 -1 -1 -1 0 0 0 1 1 1
Tỷ lệ Hydroxyproline (Hyp)/protein (Y1) và hàm lượng chất béo còn lại so với chất khô (Y2, %) là hàm mục tiêu hay biến phụ thụ thuộc được biểu diễn theo phương trình hồi quy sau:
Yi= 0+∑iXi 3 i=1 + ∑iiXi2 3 i=1 +∑ ∑ ijXiXj 3 j=i+1 2 i
Trong đó: Yi: là hàm mục tiêu; 0 là hằng số; i, ii, ij là hệ số bậc 1, bâc 2 và tương tác các biến độc lập trong phương trình hồi quy; Xi, Xj là biến độc lập.
2.3.2. Nghiên cứu quy trình thủy phân collagen da cá bằng enzyme
Trong nghiên cứu này, 3 loại enzyme đã được lựa chọn để khảo sát khả năng thủy phân collagen từ da cá ngừ. Da cá ngừ vây vàng giàu collagen được chuẩn bị theo các thông số kỹ thuật tìm được trong phần 2.2.1 được xay nhỏ bằng máy xay trục vít, kích thước lỗ xay 0,5 cm, sau đó chia thành từng túi nhỏ và trữ đông trước khi sử dụng.
Mẫu sau khi rã đông được tiến hành thí nghiệm theo Hình 2.5 để xác định điều kiện thủy phân theo từng enzyme với hàm mục tiêu là độ thủy phân (Degree of hydrolysis: DH) và hiệu suất thu hồi nitrogen (Nitrogen recovery: NR).
Hình 2.5. Sơ đồ nghiên cứu quy trình tách chiết collagen thủy phân
2.3.2.1. Thủy phân collagen của da cá ngừ vây vàng bằng enzyme pepsin
Dựa vào tổng quan tài liệu và các điều kiện của enzyme pepsin để chọn các giới hạn biên cửa các yếu tố ảnh hưởng. Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi mẫu thí nghiệm là 5 g. Thí nghiệm được thực hiện ở nồng độ enzyme pepsin 20 – 40NFU/g protein, nhiệt độ thủy phân 30 – 50 C, pH 1,5 – 3,0 và thời gian thủy phân 1 – 5 giờ. Khối lượng pepsin được tính dựa vào hoạt độ và hàm lượng protein trong mẫu. Hỗn hợp thủy phân bao gồm: mẫu da cá, enzyme pepsin, tỷ lệ nước/da cá: 1:1 (v/w). pH phản ứng được điều chỉnh bằng HCl nồng độ 1N và 0,1 N. Nhiệt độ thủy phân được được điều chỉnh bằng bể ổn nhiệt (Memmert, Đức). Khi kết thúc quá trình thủy phân, để bất hoạt enzyme, hỗn hợp thủy phân được gia nhiệt ở 95 C trong 15 phút. Sau đó, dịch thủy phân được đem ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 20 phút để loại bỏ phần cặn bên dưới. Phần dịch trong bên trên gọi là dịch collagen thủy phân được thu hồi và bảo quản ở nhiệt độ 0 – 4 C để phân tích các chỉ tiêu tiếp theo.
Khảo sát quá trình thủy phân collagen của
từng enzyme Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của thời gian Enzyme Pepsin Enzyme Flavourzym e Enzyme Alcalase Chọn enzyme có độ thủy phân và hiệu suất thu hồi nitrogen cao nhất Tối ưu hóa điều kiện
thủy phân của enzyme Da cá ngừ vây vàng giàu collagen
2.3.2.2. Thủy phân collagen của da cá ngừ vây vàng bằng enzyme flavourzyme
Dựa vào tổng quan tài liệu và các điều kiện của enzyme flavourzyme để chọn các giới hạn biên cửa các yếu tố ảnh hưởng .Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi mẫu thí nghiệm là 5 g. Thí nghiệm được thực hiện ở nồng độ enzyme flavourzyme 10 – 50 LAPU/g protein, nhiệt độ thủy phân 30 – 60 C, pH 5,0 – 8,0 và thời gian thủy phân 2 – 8 giờ. Hỗn hợp thủy phân bao gồm: mẫu da cá, enzyme flavourzyme, tỷ lệ dung dịch đệm phosphate/da cá: 1:1 (v/w). pH phản ứng được điều chỉnh bằng HCl và NaOH nồng độ mỗi chất lần lượt là 1 N và 0,1 N. Nhiệt độ thủy phân được được điều chỉnh bằng bể ổn nhiệt (Memmert, Đức). Khi kết thúc quá trình thủy phân, để bất hoạt enzyme hỗn hợp thủy phân được gia nhiệt ở 95 C trong 15 phút. Sau đó, dịch thủy phân được đem ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 20 phút để loại bỏ phần cặn bên dưới. Phần dịch trong bên trên gọi là dịch collagen thủy phân được thu hồi và bảo quản ở nhiệt độ 0 – 4 oC để phân tích các chỉ tiêu tiếp theo.
2.3.2.3. Thủy phân collagen của da cá ngừ vây vàng bằng enzyme alcalase
Dựa vào tổng quan tài liệu và các điều kiện của enzyme alcalase để chọn các giới hạn biên cửa các yếu tố ảnh hưởng .Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi mẫu thí nghiệm là 5 g. Thí nghiệm được thực hiện ở nồng độ enzyme alcalase 2.5L PF 0,01 – 0,05 AU/g protein, nhiệt độ thủy phân 45 – 65 C, pH 6,0 – 9,0 và thời gian thủy phân 3 – 7giờ. Hỗn hợp thủy phân bao gồm: mẫu da cá, enzyme alcalase 2.5L PF, tỷ lệ dung dịch đệm phosphate/da cá: 1:1 (v/w). pH phản ứng được điều chỉnh bằng HCl và NaOH nồng độ mỗi chất lần lượt là 1 N và 0,1 N. Nhiệt độ thủy phân được được điều chỉnh bằng bể ổn nhiệt (Memmert, Đức). Khi kết thúc quá trình thủy phân, để bất hoạt enzyme, hỗn hợp thủy phân được gia nhiệt ở 95 C trong 15 phút. Sau đó, dịch thủy phân được đem ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 20 phút để loại bỏ phần cặn bên dưới. Phần dịch trong bên trên gọi là dịch collagen thủy phân được thu hồi và bảo quản ở nhiệt độ 0 – 4 oC để phân tích các chỉ tiêu tiếp theo.
2.3.2.4. Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện thủy phân da cá ngừ vây vàng bằng enzyme alcalase
Trước hết, dựa vào việc khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố riêng lẻ ở mục
2.2.2.3 đến độ thủy phân (DH) và hiệu suất thu hồi nitrogen (NR) để xác định phạm vi của các biến độc lập như: Nhiệt độ thủy phân, pH, nồng độ enzyme alcalase và thời gian thủy phân. Sau đó, các tham số thủy phân được tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Response surface method (RSM). Thiết kế Box-Behnken được sử dụng để tối ưu hóa điều kiện thủy phân collagen của da cá ngừ vây vàng. Để xác định ảnh hưởng của các biến độc lập lên hàm mục tiêu, thiết kế Box-Behnken với 4 biến độc lập và được thể hiện ở 3 mức. Phạm vi và mức độ của biến độc lập được trình bày trong Bảng 2.2. Thí nghiệm được thiết kế với 4 yếu tố và 3 lần lặp lại ở điểm tâm. Sử dụng phần mềm JMP phiên bản 14.2 để phân tích bề mặt đáp ứng. Phần trăm độ thủy phân DH (Y1, %) và hiệu suất thu hồi nitrogen NR (Y2, %) được chọn là hàm mục tiêu. Các phương trình hồi quy được xác định theo công thức sau:
Yi= 0+∑iXi 4 i=1 + ∑iiXi2 4 i=1 +∑ ∑ ijXiXj 4 j=i+1 3 i
Trong đó: Yi: hàm mục tiêu; o là hằng số; i, ii, ij hệ số bậc nhất, bậc hai và tương tác giữa các biến. Xi, Xj biến độc lập.
Bảng 2.2. Giá trị mã hóa của biến độc lập
Biến độc lập Ký hiệu Phạm vi của biến
-1 0 1
Nhiệt độ thủy phân (C) pH
Nồng độ của enzyme alcalase (AU/g) Thời gian thủy phân (giờ)
X1 X2 X3 X4 -1 -1 -1 -1 0 0 0 0 1 1 1 1 Mỗi thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần
2.3.3. Tinh sạch và phân đoạn collagen thủy phân
Sơ đồ quy trình nghiên cứu tinh sạch và phân đoạn collagen được trình bày trong Hình 2.6.
Hình 2.6. Sơ đồ nghiên cứu quy trình tinh sạch và phân đoạn collagen
2.3.3.1. Xác định thành phần hóa học và phân bố khối lượng trong dịch sau ly tâm
Dịch collagen thủy phân sau khi ly tâm được xác định các thành phần hóa học như hàm lượng chất khô, lipid, tro tổng, nitơ tổng số và phân bố khối lượng phân tử của các peptide để làm cơ sở chọn màng lọc.
Bã
Xác định thành phần: Chất khô, lipid, tro tổng, Nitơ tổng
Sản phẩm 2 (SP2) -Kiểm tra độ tinh sạch của các phân đoạn - Khảo sát tính chất (hòa tan, tạo nhũ, tạo bọt, chống oxy hóa và chống đông) của các phân đoạn collagen
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Lọc màng Ảnh hưởng của áp
suất
Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của lưu lượng dòng nhập liệu
Retentate
Permeate
Sản phẩm 1 (SP1) Khảo sát tính chất (hòa tan,
tạo nhũ, tạo bọt, chống oxy hóa và chống đông) của các phân đoạn collagen thủy phân
Xác định khối lượng phân tử của các peptide collagen trong dịch thủy phân để chọn màng lọc
Tách và khảo sát tính chất (hòa tan, tạo nhũ, tạo bọt, chống oxi hóa và chống đông) của các phân đoạn collagen thủy phân
lipid, tro tổng, nitơ tổng
Lọc sơ bộ Ly tâm Dịch lọc Dịch ly tâm phân Tách các phân đoạn
2.3.3.2. Làm sạch sơ bộ
Dịch collagen thủy phân được lọc qua giấy lọc Whatman (đường kính
180mm, lỗ lọc có kích thước 4-7 µm) bằng thiết bị lọc chân không. Dịch lọc thu được đem ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, trong 30 phút với nhiệt độ dịch đem ly tâm là 4 C. Loại bỏ phần chất rắn bên dưới lấy phần dịch bên trên để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.3.3. Phân đoạn collagen và khảo sát các hoạt tính của các phân đoạn
Sắc ký lọc gel (GPC) được dùng để tách các phân đoạn collagen ra khỏi phần dịch collagen thủy phân bằng cách hứng sản phẩm đầu ra của sắc ký theo thời gian lưu của các phân đoạn khi sắc ký. Các phân đoạn được kiểm tra các tính chất như khả năng hòa tan, khả năng tạo nhũ, khả năng tạo bọt, khả năng chống oxy hóa và chống đông.
2.3.3.4. Xác định điều kiện lọc màng
Thí nghiệm lọc màng được thực hiện trên thiết bị QuixStand Benchtop System (GE, Mỹ) với màng UFP-1-C-6 (GE, Mỹ) với chất liệu màng là polysulfone, chiều dài màng lọc 63,5 cm và đường kính trong hộp lọc 3,2 cm, kích thước lỗ lọc 1000 NMWC, điện tích màng lọc 0,48 m2. Quá trình lọc được thực hiện gián đoạn mỗi mẻ lọc là 3000 ml. Dịch collagen thủy phân trước khi đưa vào thí nghiệm lọc màng được làm sạch sơ bộ (mục 2.2.3.2) và xác định sự phân bố khối lượng phân tử của các peptide trong dịch collagen thủy phân bằng sắc ký lọc gel (mục 2.2.3.1). Trước khi lọc màng lọc được rửa bằng cồn 50 Vol và rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết cồn. Ổn định nhiệt cho nguyên liệu lọc bằng bể ổn nhiệt (Memmert, Đức) trước khi bơm vào màng lọc.
a. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thể tích mẫu trong mỗi thí nghiệm là 3000 ml. Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ dịch lọc là: 5 C; 10 C; 15 C; 20 C; 25 C; 30 C và 35 C. Các yếu tố cố định là: thời gian lọc là 30 phút (tính từ khi ổn định màng); pH 7,0, lưu lượng dòng
nhập liệu là 1,5 lít/phút, áp suất dòng vào là 10 psi, TMP 9 psi. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Thông lượng qua màng, độ phân riêng và hiệu suất thu hồi nitrogen.
b. Khảo sát ảnh hưởng của áp suất đầu vào
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thể tích mẫu trong mỗi thí nghiệm là 3000 ml. Thí nghiệm được thực hiện ở áp suất là: 6 psi; 8 psi; 10 psi; 12 psi và 14 psi. Các yếu tố cố định là: thời gian lọc là 30 phút (tính từ khi ổn định màng); pH 7,0, lưu lượng dòng nhập liệu là 1,5 lít/phút, đầu vào và đầu ra cột lọc luôn chênh lệch nhau 2 psi và nhiệt độ (đã xác định ở mục a). Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Thông lượng qua màng, độ phân riêng và hiệu suất thu hồi nitrogen
c. Khảo sát ảnh hưởng của pH
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thể tích mẫu trong mỗi thí nghiệm là 3000 ml. Thí nghiệm được thực hiện ở pH là: 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0. Các yếu tố cố định là: thời gian lọc là 30 phút (tính từ khi ổn định màng), lưu lượng dòng nhập liệu là 1,5 lít/phút và nhiệt độ, áp suất (đã xác định ở mục a, mục b). Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Thông lượng qua màng, độ phân riêng và hiệu suất thu hồi nitrogen.
d. Khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng dòng nhập liệu
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thể tích mẫu trong mỗi thí nghiệm là 3000 ml. Thí nghiệm được thực hiện ở lưu lượng dòng nhập liệu là: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 lít/phút. Các yếu tố cố định là: thời gian lọc là 30 phút (tính từ khi ổn định màng), nhiệt độ, áp suất và pH (đã xác định ở mục a, mục b và mục c). Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Thông lượng qua màng, độ phân riêng và hiệu suất thu hồi nitrogen.
2.3.4. Ứng dụng collagen thủy phân vào thực phẩm
2.3.4.1. Ứng dụng phân đoạn (SP1) vào sản xuất nước uống chanh dây collagen
Thí nghiệm 1: Xác định tỷ lệ phối trộn nước
Mục tiêu: Xác định tỷ lệ nước phối trộn với dịch quả chanh dây sao cho sản phẩm có giá trị cảm quan cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại. Mỗi mẫu thí nghiệm là 2 kg chanh dây để sản xuất 2 lít nước uống chanh dây.
Yếu tố thí nghiệm: Tỷ lệ nước phối trộn: 30%; 35%; 40%; 45%; 50% và 55% so với dịch quả chanh dây.
Các yếu tố cố định:
+ Tỷ lệ collagen thủy phân 0,1% so với dịch quả chanh dây + Tỷ lệ axit citric 0,1% so với dịch chanh dây
+ Dung dịch siro 30% so với dịch quả chanh dây + Nhiệt độ thanh trùng 90 ºC, thời gian 20 phút Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Điểm cảm quan của sản phẩm
Thí nghiệm 2: Xác định tỷ lệ phối trộn axit citric
Mục tiêu: Xác định tỷ lệ axit citric để cho sản phẩm có giá trị cảm quan cao