Khi collagen hoặc gelatin bị thủy phân bởi enzyme tạo thành các peptide có khối lượng phân tử nhỏ hơn 20 kDa thì hỗn hợp thu được gọi là collagen thủy phân (collagen hydrolysate: CH) (Djagny và ctv, 2001; Zague, 2008; Boonmaleerat và ctv, 2017). Tùy thuộc vào loại enzyme mà sản phẩm có mức độ thủy phân khác nhau. Việc tách chiết các phân đoạn sẽ tạo ra các sản phẩm collagen thủy phân khác nhau. Protease là enzyme thủy phân liên kết peptide của phân tử protein. Enzyme protease gồm hai loại: endoprotease và exoprotease. Các endoprotease như trypsin, chymotrypsin, chymosin thủy phân các liên kết peptide ở bên trong chuỗi
polypeptide. Các exoprotease cắt các liên kết ở hai đầu tận cùng của chuỗi polypeptide, các exoprotease cắt vào đầu có nhóm carboxyl tận cùng được gọi là carboxylpeptidase còn những enzyme tác dụng vào đầu có nhóm amin tận cùng gọi là aminopeptidases. Các endoprotease và exoprotease kết hợp với nhau tạo hiệu quả cao trong việc phân giải protein. Có thể nói rằng, chức năng chính của endoprotease là tạo ra một lượng lớn các chuỗi peptide có đầu C và đầu N tự do để tạo điều kiện cho các exoprotease hoạt động.
Tuy nhiên, tác dụng của các protease rất phức tạp, bản chất của các mạch nhánh của axit amin có ảnh hưởng mạnh đến hoạt động của các enzyme. Trên thực tế, các protease rất đặc hiệu và tỷ lệ những liên kết peptide trong một phân tử protein bị bẻ gãy bởi một protease là không cao. Ví dụ, trypsin chỉ thủy phân liên kết peptide giữa lysine và argininine; chymotrypsin chỉ thủy phân những liên kết peptide giữa tyrosine, phenylalanine, tryptophan. Thậm chí chymosin chỉ thủy phân liên kết peptide giữa Phe105-Met106 của kappa-casein (Rawlings và Barrett, 2013).
Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại protease như pepsin, flavourzyme, alcalase, neutrase và protamex. Mỗi loại enzyme có tính đặc hiệu và thủy phân các liên kết peptide khác nhau. Do đó đối với cùng một cơ chất thì mỗi enzyme sẽ tác động khác nhau, tạo ra các sản phẩm có độ thủy phân khác nhau. Khi độ thủy phân càng cao thì các peptide thu được có khối lượng phân tử càng nhỏ và khả năng hòa tan tăng. Một số enzyme thường dùng để tách chiết collagen từ da cá ngừ vây vàng bao gồm pepsin, flavourzyme, alcalase. Độ thủy phân của một số enzyme protease được trình bày trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2. So sánh độ thủy phân collagen của các enzyme Enzyme Độ thủy phân
(DH) (%) Nguồn nguyên liệu Nguồn
Pepsin 18,39
Phụ phẩm cá ngừ sọc dưa (Skipjack Tuna (Katsuwonus pelamis) (Qiu và ctv, 2019) Papain 15,39 Trypsin 19,64 Neutrase 21,67 Alcalase 25,35
Flavourzyme 25 Protein cá rô phi (Raghavan & Kristinsson, 2009) Protamex 22,5 Đuôi cá ngừ vây vàng (Nguyen và ctv, 2011)
Pepsin là một trong ba protease chính trong hệ thống tiêu hóa của con người và nhiều động vật khác, hai loại còn lại là chymotrypsin và trypsin. Trong quá trình tiêu hóa, các enzyme này, mỗi enzyme chuyên cắt đứt liên kết giữa các loại axit amin cụ thể để tạo thành các peptide nhỏ và axit amin, có thể dễ dàng hấp thụ bởi ruột non. Enzyme pepsin được sản xuất từ dạ dày của động vật hoặc từ vi sinh vật. Là một endopeptidase thuộc nhóm aspartic protease, pepsin cho hiệu quả cao trong việc phân cắt các liên kết peptide nội mạch giữa các axit amin kỵ nước và tốt nhất là các axit amin thơm như phenylalanine, tryptophan và tyrosine. Pepsin hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ từ 37 – 42 C và pH 1,5 – 2,0 (Rawlings và Barrett, 2013)
Flavourzyme là một phức hợp protease/peptidase của nấm được tạo ra bởi quá trình lên men chìm của một chủng Aspergillus oryzae đã được biến đổi gen và nó có chứa cả hoạt động của endoprotease và exopeptidase. Độ pH tối ưu cho phức hợp enzyme nằm trong khoảng 5,0 – 7,0. Nhiệt độ tối ưu cho enzyme là khoảng 50 C.
Alcalase là protease của Bacillus licheniformis với hoạt tính endopeptidase. Alcalase là enzyme thương mại thuộc nhóm serine protease subtilisin A. Hoạt tính của Alcalase 2,5L là 2,5 AU/g, bị ức chế ở pH thấp hoặc nhiệt độ cao, điều kiện hoạt động tốt nhất của Alcalase là pH = 6,5 – 8,5; nhiệt độ 45 – 65 C (Ng và Mohd Khan, 2012). Alcalase đã được chứng minh là một trong những enzyme tốt nhất được nhiều nhà nghiên cứu dùng để chế biến thủy phân protein cá (Bhaskar và ctv, 2008).
Enzyme này thủy phân protein tạo các axit amin kỵ nước vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có vị đắng, đồng thời sản phẩm có sự cân bằng về các axit amin thiết yếu (Kristinsson và Rasco, 2000). Alcalase còn được ưa chuộng và được sử dụng rộng rãi do đây là enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn, có khả năng xúc tác mạnh, ổn định với pH và nhiệt độ (Diniz và Martin, 1997). Các báo cáo trước đây cho thấy sản phẩm thủy phân bằng alcalase ít đắng so với papain. Alcalase cũng được là lựa chọn tốt nhất cho thủy phân protein dựa trên chi phí enzyme trên mỗi đơn vị hoạt động (Kristinsson và Rasco, 2000).
Trong những năm gần đây, một số nhà khoa học đã nghiên cứu việc sử dụng enzyme để thủy phân collagen từ da cá (Nikoo và ctv, 2015; Chen và ctv, 2017; Hema và ctv, 2017; Wu và ctv, 2018). Đối với da cá hồi, Wu và ctv (2018) đã sử dụng enzyme từ Vibrio sp. SQS2-3 với tỷ lệ E/S = 1:10 (v/w), pH 4, nhiệt độ thủy phân là 45 C, thời gian thủy phân là 150 phút để độ thủy phân đạt cực đại; dịch thủy phân thu được tách thành 2 phân đoạn, UF1 3kDa và UF2 3kDa. Khi thủy phân da cá hồi bằng enzyme serine collagenolytic protease từ vi khuẩn Pseudoalteromonas sp. SM9913 với hoạt độ 10434 U/mg, pH 8, nhiệt độ 40 C, tỷ lệ E/S = 1/10 (v/w), thời gian thủy phân 1 giờ thì thu được trên 95% các peptide có khối lượng phân tử nhỏ hơn 3 kDa (Chen và ctv, 2017). Đối với da cá Epinephelus malabaricus, với 3 loại enzyme khác nhau là pepsin, papain và protease ở điều kiện tối ưu cho mỗi enzyme thì độ thủy phân cực đại đối với mỗi enzyme là khác nhau. Độ thủy phân của pepsin, papain và protease lần lượt là 10%, 20% và 28% (Hema và ctv, 2017). Độ thủy phân càng cao thì các phân đoạn peptide trong dịch thủy phân càng nhỏ và khả năng hòa tan của sản phẩm thu được càng tốt. Da cá Acipenser schrenckii đã được thủy phân bằng enzyme Alcalase (Sigma, USA) với tỷ lệ Alcalase/cơ chất 1:20 (w/w) ở 50 C, pH 8 trong 3 giờ; trong khi đó flavourzyme (Sigma, USA) hoạt động tốt ở tỷ lệ flavourzyme /cơ chất 1:20 (w/w), ở 50 C, pH 7 trong 3 giờ và peptide thu được có phân tử lượng hầu hết ở vùng từ 500 đến 2500 Da (Nikoo và ctv, 2015).
Như vậy quá trình thủy phân collagen hoặc gelatin từ da cá bằng các loại enzyme có độ thủy phân khác nhau sẽ cho các peptide có khối lượng phân tử khác
nhau. Với mục đích tạo ra các peptide collagen có khối lượng phân tử nhỏ có hoạt tính sinh học cao, các enzyme có độ thủy phân cao đã được chọn để khảo sát trong nghiên cứu này.