a. Chuẩn bị tế bào DH5α khả nạp
Sau khi tiến hành nối gene mục tiêu vào plasmid pET-22b, cần phải đưa plasmid nối thành công vào trong tế bào E. coli để nhân số lượng bản sao plasmid này lên. Chủng E. coli thường được sử dụng để lưu trữ và nhân số lượng bản sao plasmid thường được sử dụng đó là chủng tế bào E. coli DH5α. Các tế bào E. coli
muốn tiếp nhận được DNA ngoại lai cần phải được xử lý để tăng khả năng tiếp nhận DNA. Tế bào có khả năng tiếp nhận DNA được gọi là tế bào khả nạp. Có nhiều phương pháp xử lí tế bào chủ để làm tăng khả năng biến nạp là vật lí và hóa học. Trong phương pháp hóa học, sự hiện diện của ion Ca2+ ở nhiệt độ thấp (0-4oC) sẽ giúp việc biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli đạt hiệu quả cao. Ion Ca2+ có thể gây ra những xáo trộn trên màng tế bào làm cho DNA xâm nhập vào tế bào dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (42oC trong 90 giây) để kích thích sự chuyển của phân tử plasmid vào tế bào. Môi trường dưỡng chất được cho vào sau đó giúp phục hồi tế bào và plasmid ngoại lai sẽ được sao mã, dịch mã để tạo protein tương ứng. Quy trình biến nạp được tiến hành theo quy trình chuẩn của Bộ môn CNSH Phân tử & Môi trường.
Cách tiến hành
- Cấy một khuẩn lạc đơn E. coli DH5α vào 5ml môi trường LB, lắc 250 vòng/phút ở 37oC qua đêm.
- Đo OD600 và tính toán lượng thể tích cấy chuyền sang erlen chứa 100 ml LB để OD600 cuối đạt 0,08. Tiếp tục lắc 250 vòng/phút ở 37oC cho đến khi OD600 đạt khoảng 0,4-0,5 thì lấy erlen ra và ngâm đá lạnh khoảng 30 phút.
- Chuyển dịch nuôi cấy vào 2 ống falcon vô trùng rồi ly tâm 6.000 vòng/phút, ở 4oC trong 15 phút để thu sinh khối.
- Rửa sinh khối với khoảng 7ml dung dịch CaCl2-MgCl2 (20mM-80mM), vortex nhẹ, ly tâm tương tự để thu sinh khối.
- Thêm 6,7ml CaCl2 100mM và 2,1ml glycerol 80%, trộn nhẹ đều và cất giữ tế bào ở tủ âm.
- Tất cả các bước được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
b. Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α khả nạp
Trộn 10l hỗn hợp sản phẩm nối được trộn đều vào 100l tế bào E. coli DH5α khả nạp trong eppendorf. Thực hiện sốc nhiệt theo qui trình sau:
- Để lạnh 4oC trong 10 phút, - Giữ 45oC trong 90 giây, - Giữ lạnh 4oC trong 15 phút.
Sau đó chuyển hỗn hợp này lên đĩa LB-Amp100 và trải. Đĩa sau khi trải sẽ được ủ 37oC trong khoảng 16-18 giờ. Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng là tế bào khả nạp E. coli DH5 không được bổ sung sản phẩm nối trong quá trình biến nạp.
c. Tuyển chọn dòng tái tổ hợp mang gene higf-1
Thể biến nạp tiếp nhận plasmid tái tổ hợp thường được phát hiện dựa trên các nhân tố chọn lọc và thông thường là khả năng kháng kháng sinh. Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và biểu hiện gene kháng kháng sinh trong tế bào chủ. Điều này giúp tế bào có khả năng sinh trưởng trên môi trường có kháng sinh. Do đó, sau khi ủ ở 37oC trong 16 giờ, quan sát các khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường thí nghiệm và đĩa đối chứng. Những thể biến nạp này tiếp tục được kiểm tra bằng các phương pháp sau:
- PCR khuẩn lạc bằng mồi đặc hiệu cho gene higf-1 với mục đích xác định xem các thể biến nạp có chứa gene mục tiêu mong muốn hay không.
MiliQ 15l
Buffer Taq 10X 2,5l
MgCl2 2,5l
dNTP (8mM) 2,5l
Mồi 5’-NdeI-higf1(10 pmol) 1l Mồi 3’-BamHI-higf1(10 pmol) 1l Taq DNA polymerase (1u/l) 0,5l
Tổng thể tích phản ứng 25l
- PCR plasmid thu nhận từ khuẩn lạc cho kết quả PCR dương tính bằng cặp mồi T7pro/ T7ter để kiểm tra vị trí chèn của gene higf-1 trên plasmid và bằng cặp mồi 5’-NdeI-higf1/ T7ter để kiểm tra chiều của gene mục tiêu.
Thành phần phản ứng:
MiliQ 14l
Buffer Taq 10X 2,5l
MgCl2 (25mM) 2,5l
dNTP (8mM) 2,5l
Mồi T7 pro /5’-NdeI-higf1 (10 pmol) 1l
Mồi T7 ter (10 pmol) 1l (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
pET22b-higf1 1,0l
Taq DNA polymerase (1u/l) 0,5l
Tổng thể tích phản ứng 25l
- Kiểm tra bằng phản ứng cắt với hai enzyme NdeI và BamHI Thành phần phản ứng:
MiliQ 4,0l
Buffer Tango 10X 4,0l
Plasmid pET22b-higf1 10,0l
NdeI (10u/l) 1,0l
BamHI (10u/l) 1,0l
- Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phương pháp giải trình tự
Vector tái tổ hợp pET22b-higf1 được tiến hành giải trình tự với cặp mồi T7 pro/T7 ter theo phương pháp Sanger cải tiến trên máy Big DyeTM terminator bởi công ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được đem so sánh với trình tự gene higf-1 thiết kế ban đầu.
2.2.4. Tạo dòng tế bào E. coli Origami(DE3) mang vector pET22b-higf1
Do gene higf-1 trên plasmid pET22b-higf1 nằm dưới sự kiểm soát của T7 promoter nên để biểu hiện được gene mục tiêu cần phải chuyển plasmid này vào các hệ thống tế bào E. coli có mang gene DE3 mã hóa cho T7 RNA polymerase và trong trường hợp này là tế bào E. coli Origami(DE3). Đây là dòng tế bào chủ có hai đột biến trxB và gor giúp tăng cường khả năng hình thành cầu nối disulfide, thích hợp cho trường hợp protein hIGF-1 với ba cầu nối disulfide nội phân tử.
Thu nhận plasmid pET22b-higf1 và chuẩn bị tế bào E. coli Origami(DE3) khả nạp tương tự như tế bào E. coli DH5α, thực hiện hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E. coli Origami(DE3) và trải trên đĩa môi trường LB-Amp100-Kana40, ủ 37oC qua đêm. Những khuẩn lạc mọc được trên môi trường này là những khuẩn lạc biến nạp thành công vector tái tổ hợp, chúng được chọn để kiểm tra một lần nữa bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi T7 pro/T7 ter. Khuẩn lạc cho kết quả PCR dương tính được chọn để biểu hiện protein mục tiêu.
2.2.5. Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 ở E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1
a. Cảm ứng biểu hiện hIGF-1
- Cấy một khuẩn lạc đơn E. coli Origami(DE3) có mang plasmid pET22b-
higf1 vào ống nghiệm chứa 5 ml LB có bổ sung kháng sinh ampicillin ở nồng độ 100g/ml và kanamycin 40g/ml. Lắc 250 vòng/phút ở 37oC qua đêm.
- Cấy chuyền 250l vào ống 5ml LB có bổ sung ampicillin và kanamycin và nuôi cấy lắc cho đến khi OD600 đạt giá trị khoảng 0.4-0.6 thì bổ sung chất cảm ứng IPTG ở nồng độ cuối 0,5mM. Nuôi cấy lắc 250 vòng/phút ở 25oC trong 4 giờ.
- Tiến hành song song trong cùng điều kiện các mẫu nghiệm thức đối chứng là chủng E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 không cảm ứng và chủng E. coli
Origami(DE3) không mang vector tái tổ hợp.
b. Thu nhận protein hIGF-1 ở các phân đoạn khác nhau trong tế bào
Để kiểm tra protein biểu hiện trong tế bào E. coli tồn tại ở dạng tan hay dạn không tan cần phải phá tế bào và thu nhận các phân đoạn protein tan và không tan thông qua bước ly tâm. Có nhiều phương pháp phá màng để thu nhận protein trong tế bào. Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng phương pháp vật lí (Sonicate-sóng siêu âm). Phương pháp sóng siêu âm có thể đồng nhất mô, phá màng tế bào, cắt đại phân tử, do đó ứng dụng chính trong sinh học là phân tách các đại phân tử ra khỏi tế bào. Vai trò chính của sóng siêu âm trong ứng dụng này là do có thể làm tăng khả năng thấm qua màng. Nguyên lí của phương pháp là sự mở rộng và nén ép của sóng siêu âm qua môi trường lỏng dẫn đến hình thành các bọt bóng cực nhỏ (còn gọi là sủi bọt), các bóng này vỡ ra sẽ làm màng tế bào bị vỡ theo tạo các lỗ hổng.
- Rửa sinh khối lại với nước cất, ly tâm như trên thu lại sinh khối. Thêm dung dịch ly giải tế bào vào để hòa đều sinh khối.
- Sonicate ở 4oC dịch trong eppendorf cho đến khi dịch trong. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC, thu tủa và nổi riêng.
- Phần nổi và tủa được giữ ở -20oC và kiểm tra bằng Tricine SDS-PAGE.
c. Kiểm tra sự biểu hiện hIGF-1 trong tế bào E. coli bằng Tricine SDS-PAGE
Vì protein hIGF-1 có trọng lượng phân tử 7,6kDa nên không thể phân tách bằng phương pháp Glycine SDS-PAGE bình thường do đó chúng tôi chọn sử dụng phương pháp Tricine SDS-PAGE để phân tích. Tricine Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine SDS-PAGE) là kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide, được cải tiến từ điện di glycine SDS-PAGE bởi Schägger và Von Jagow, sử dụng tricine thay thế cho glycine trong dung dịch đệm chạy điện di, nồng độ polyacrylamide thấp hơn. Tricine SDS-PAGE phân tách một cách hiệu quả protein có khối lượng phân tử thấp trong phạm vi 1-100 kDa. Trong gel glycine SDS-PAGE, việc phân tách các protein kích thước nhỏ với sự hiện diện SDS là khó khăn. Tricine SDS-PAGE sẽ giảm mức độ ảnh hưởng của SDS với các protein đó
nên kết quả sẽ thấy các vạch protein được phân tách và hiện rõ trên gel. Với mục đích đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát, đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta sử dụng phương pháp điện di không liên tục qua hai lớp: gel gom (lớp trên), gel phân tách (lớp dưới) [25].
Cách tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lần lượt đổ gel theo thứ tự gel phân tách (separating gel) và gel gom (stacking gel). Lắp lược ở phía trên gel gom. Sau khi gel đông, lấy lược ra, lắp bản gel vào bồn điện di, cho dung dịch điện di vào bồn.
- Biến tính mẫu bằng cách thêm sample buffer 6X vào mẫu theo tỉ lệ thể tích, vortex đều. Đun ở 100oC trong 15 phút, ủ đá 10 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi.
- Nạp 10µl mẫu vào mỗi giếng, tiến hành điện di với hiệu điện thế là 30V và cường độ dòng điện cho mỗi giếng là 2mA trong vòng 60 phút để cho các protein gom về cùng vị trí xuất phát trong gel gom. Sau đó chuyển sang hiệu điện thế 100V trong vòng 90 phút.
- Sau khi điện di, gỡ gel ra khỏi bản gel, để gel vào dung dịch nhuộm và nhuộm 45 phút. Tiến hành giải nhuộm trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi gel trong và trông thấy vạch rõ.
d. Xác nhận sự biểu hiện protein hIGF-1 bằng Western blot
Nhằm xác định xem protein biểu hiện vượt mức trên bản gel Tricine SDS- PAGE có phải là protein hIGF-1 hay không chúng tôi tiến hành lai Western với kháng thể đặc hiệu kháng protein hIGF-1. Mẫu protein được điện di trên gel Tricine SDS-PAGE và được chuyển lên màng nitrocellulose bằng tác nhân điện. Protein chuyển lên màng được phát hiện thông qua việc sử dụng kháng thể đặc hiệu cho protein bằng cách trực tiếp (dùng một loại kháng thể đã được đánh dấu) hoặc gián tiếp (dùng kháng thể sơ cấp không được đánh dấu và kháng thể sơ cấp được đánh dấu để phát hiện kháng thể sơ cấp). Chất đánh dấu gồm có biotin, chất phát huỳnh quang như fluorescein hoặc rhodamine hoặc dạng kết hợp với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase. Chất kết hợp với enzyme thường
được sử dụng là các hóa chất có khả năng phát sáng, tín hiệu ánh sáng phát ra sẽ được ghi nhận bằng phim hay các thiết bị ghi màu khác.
Chuyển thẩm protein từ gel lên màng lai
- Điện di Tricine SDS-PAGE các mẫu cùng với thang phân tử lượng nhỏ. - Sau khi cắt bỏ gel gom, ngâm và lắc nhẹ gel phân tách trong dung dịch Towbin-methanol trong 5 phút. Đồng thời chuẩn bị một màng lai cellulose và hai tấm giấy thấm có kích thước phù hợp với miếng gel.
- Ngâm màng lai và giấy thấm trong dung dịch chuyển màng, sau đó xếp theo thứ tự: cực âm, miếng xốp, giấy lọc, gel, màng lai, giấy lọc miếng xốp, cực dương.
- Khóa bộ chuyển màng.
Lắp bộ điện di, điện di chuyển thẩm với hiệu điện thế 20V, cường độ 200mA trong 30 phút.
Lai với kháng thể đặc hiệu
- Chuyển nhẹ nhàng màng lai vào hộp nhựa chứa 10 ml dung dịch khóa màng gồm sữa gầy trong 10 ml PBST, lắc nhẹ trong một giờ cho dung dịch tiếp xúc đều với bề mặt của màng lai.
- Sau đó rửa kĩ màng bằng dung dịch PBST, mỗi lần 3-5 phút.
- Ngâm màng lai trong kháng thể kháng hIGF-1(1:10.000) trong 1 giờ, đồng thời lắc nhẹ nhàng hộp.
- Sau đó rửa kĩ màng 10 lần, mỗi lần 5 phút.
- Tiếp tục ủ màng với kháng thể thứ cấp đánh dấu bằng HRP pha loãng trong dung dịch PBST với tỉ lệ 1:10.000 trong 1 giờ, đồng thời lắc nhẹ hộp.
- Sau đó rửa kĩ màng bằng dung dịch PBST 10 lần, mỗi lần 5 phút.
Hiện phim
- Phủ khắp bề mặt màng bằng hỗn hợp dung dịch phát hiện 1 và 2.
- Chuyển vào phòng tối, đặt nhẹ nhàng phim trong lên màng lai, giữ cố định vị trí màng và phim trong 20 phút.
- Sau đó nhúng phim vào dung dịch hiện phim cho đến khi thấy xuất hiện vạch mục tiêu rồi nhanh chóng rửa phim bằng dung dịch fixer đến khi phim trong suốt.