3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.2.5. Nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long
của vật liệu nano silica, oligochitosan và nano silica/oligochitosan.
2.2.5.1. Chuẩn bị dịch bào tử nấm Neoscytalidium dimidiatum.
Môi trường thạch PDA (Potato dextrose agar) và môi trường lỏng PDB (Potato dextrose both) được hấp tiệt trùng bằng thiết bị autoclave ở áp suất hơi nước 1,1
kg.cm-2 và nhiêt độ 121oC trong 30 phút trước khi sử dụng. Quy trình chuẩn bị dịch bào tử nấm Neoscytalidium dimidiatum bao gồm các bước như sau:
Bước 1: Giống nấm Neoscytalidium dimidiatum được nhân giống cấp 1 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng (28 ± 2oC) trong 5 ngày.
Bước 2: Cấy chuyền nấm Neoscytalidium dimidiatum vào 200 mL dung dịch môi trường PDB chứa trong bình tam giác 500 mL. Bình chứa nấm được nuôi trên máy lắc liên tục (tốc độ khuấy 120 vòng.phút-1) ở nhiệt độ phòng (28 ± 2oC) trong thời gian 4 ngày thu được dịch huyền phù nấm Neoscytalidium dimidiatum có mật độ 1 x 104 Cfu.mL-1. Dịch huyền phù nấm sử dụng để nghiên cứu in vivo hiệu ứng kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long của các vật liệu nano silica, oligochitosan và nano silica/oligochitosan theo phương pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo.
2.2.5.2. Nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long.
Thí nghiệm nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long theo phương pháp tác giả Zahid (2014) [127]; Ali (2014) [128], Thanh (2016) [118] và theo TCCS 162:2014/BVTV [129]. Các điều kiện thí nghiệm như sau: Giống thanh long ruột trắng 5 năm tuổi. Phân bón sử dụng trong thí nghiệm dựa trên nhu cầu dinh dưỡng của cây thanh long là 250 gr N + 165 gr P2O5 + 250 gr K2O/trụ/vụ, bón làm 3 đợt là sau thu hoạch, trước khi ra hoa và sau khi đậu quả.
Kích thước của mỗi ô thử nghiệm là 9 trụ (81 m2), giữa các ô thí nghiệm được ngăn cách bằng một hàng trụ thanh long xung quanh để khi xử lý vật liệu và lây nhiễm nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum từ không bay từ ô này sang ô khác. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
Thí nghiệm bao gồm các vật liệu xử lý: oligochitosan có khối lượng phân tử ~3.000 g.mol-1 (OC3000); ~5.000 g.mol-1 (OC5000); ~7.000 g.mol-1 (OC7000); nano silica và nano SiO2/OC3000 với nồng độ phun 150 mg.L-1; thí nghiệm đối chứng âm phun nước lã và không lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum; thí nghiệm đối chứng dương phun nước lã và không lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum.
Phương pháp xử lý vật liệu và lây nhiễm nhân tạo nấm Neoscytalidium dimidiatum gồm các bước như sau:
Bước 1: Các trụ thanh long được xử lý các vật liệu ướt đều với thể tích phun từ 2 - 2,5 lít/trụ.
dịch bào tử nấm Neoscytalidium dimidiatum có mật độ 1 102 Cfu.mL-1 ướt đều trụ thanh long với thể tích 1,5 lít/trụ.
Thu mẫu thí nghiệm: Dây thanh được cắt tại 3 vị trí khác nhau trên cùng một cây, mỗi đoạn 20 cm, mẫu được bảo quản lạnh từ 0 – 5oC. Mẫu dây thanh long được xử lý bằng nitơ lỏng trước khi nghiền. Nghiền 50 g mẫu với 50 mL dung dịch đệm phốtphat (pH 7,5), ly tâm và thu dịch để xác định hoạt tính enzyme chitinase.
Xác định hoạt độ enzyme chitinase, tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu tại thời điểm trước lây nhiễm và thời gian 24 giờ, 72 giờ, 120 giờ, 168 giờ sau lây nhiễm bào tử nấm Neoscytalidium dimidiatum trên dây thanh long.
Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase trong cây thanh long.
Hoạt độ enzyme chitinase trên cây thanh long được xác định theo phương pháp được mô tả bởi các tác giả Miller (1959) [130] và tác giả Tonon và cs (1998) [131].
Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân chitin bởi chitinase thành
N-acetylglucosamin (GlcNAc) theo cơ chế trình bày trong Hình 2.6.
Hình 2.6. Phản ứng thủy phân chitin bằng enzyme chitinnase.
GlcNAc là một loại đường khử. Đường khử trong môi trường kiềm nóng sẽ khử thuốc thử DNS (axit 3,5-dinitrosalicylic) màu vàng thành axit 3-amino-5- nitrosalicylic màu đỏ da cam (Hình 2.7). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với mật độ quang (OD - Optical density) tại bước sóng 540 nm và hàm lượng đường khử trong mẫu.
Hình 2.7. Phản ứng của đường khử với thuốc thử DNS.
Dựa vào đồ thị chuẩn với nồng độ của N-acetylglucosamin tinh khiết và OD ở 540 nm tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu, qua đó biết được
Axit 3,5-dinitrosalicylic (màu vàng)
Axit 3-amino-5-nitrosalicylic (màu da cam)
Đường khử trong môi trường kiềm nóng
hoạt tính chitinase của enzyme.
Tiến hành: Hàm lượng chitinase xác định bằng cách đo lượng N-acetyl- glucosamine được giải phóng từ phản ứng thủy phân chitin. Keo chitin (10 mg.mL-1
hòa trong dung dịch đệm phốtphat, pH 7,5) được sử dụng làm cơ chất phản ứng với enzyme. Hỗn hợp phản ứng enzyme gồm 2 mg.mL-1 huyền phù chitin ở pH 7,5 và 2 mL dịch chiết enzyme được ủ thời gian 3 giờ trong bể ổn nhiệt 45oC. Dừng phản ứng bằng cách đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm nguội đến nhiệt độ phòng và bổ sung 2 mL dung dịch NaOH 2M. Hỗn hợp dung dịch phản ứng (6 mL) được chia ra làm 02 ống nghiệm. Tiếp theo, mỗi ống được thêm 1 mL DNS, đun sôi cách thủy trong 5 phút và làm nguội xuống nhiệt độ phòng (~30oC). Dung dịch trong ống nghiệm đưa vào cuvet để đo cường độ hấp thụ tại bước sóng 540 nm trên máy UV- vis. Cường độ hấp thụ trung bình của dung dịch trong 2 ống nghiệm nêu trên được xác định trên thiết bị UV- Vis Model V630; hãng Jasco - Nhật Bản tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ TP.HCM và so sánh với đường chuẩn để xác định hàm lượng đường khử giải phóng ra.
Dung dịch Glc-NAc trong đệm phosphate với nồng độ từ 0,1 đến 1,0 μmol.mL- 1 được sử dụng để thiết lập đường chuẩn (y = 1,3587x - 0,1538; R2 = 0,9949) để biểu diễn sự phụ thuộc cường độ hấp thụ vào lượng đường khử. Hoạt độ chitinase (CA) của các mẫu cây thanh long được tính theo công thức:
CA = (X.k.V).(v.t)-1
Trong đó: CA là hoạt tính enzyme chitinase (U/g); X là lượng đường khử được giải phóng trong quá trình thủy phân chitin (g.g-1); k là hệ số pha loãng; V là tổng thể tích của dịch phản ứng (mL); v là thể tích của dịch chiết enzyme sử dụng (mL); t là thời gian phản ứng (phút).
Phương pháp xác định tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu thanh long [118, 127, 129].
Mỗi ô thí nghiệm chọn ngẫu nhiên 3 trụ thanh long để điều tra cố định trong suốt thời gian thực hiện. Trên mỗi trụ theo dõi 16 dây cố định, đại diện cho 4 hướng, mỗi dây theo dõi một đoạn dài 50 cm (được tính từ đỉnh cành trở vào). Quan sát và phân cấp mức độ bệnh ở cả 3 mặt của đoạn dây thanh long tại thời điểm 24 giờ, 72 giờ, 120 giờ và 168 giờ sau khi phun dịch lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum. Đánh giá tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu trên trụ thanh long như sau:
long điều tra) x 100
Chỉ số bệnh được tính theo công thức Townano Send- Heuberger:
Chỉ số bệnh (%) = 100 9 3 5 7 9 9 7 5 3 1 x N n n n n n
Trong đó: N: Tổng số đoạn dây điều tra
Cấp bệnh Triệu chứng n1 n3 n5 n7 n9
1% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh < 10% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh < 25% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh < 50% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh ≥ 50% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh
Hiệu lực sinh học của vật liệu (%): được tính theo công thức Henderson- Tilton:
Hiệu lực (H), % = [1-(Ta x Cb)/(Tb x Ca)] x 100
Trong đó: Ta: Chỉ số bệnh ở công thức xử lý vật liệu sau lây nhiễm. Tb: Chỉ số bệnh ở công thức xử lý thuốc trước lây nhiễm. Ca: Chỉ số bệnh ở công thức đối chứng sau lây nhiễm. Cb: Chỉ số bệnh ở công thức đối chứng trước lây nhiễm.