Chương 4 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định nguyên nhân gây bệnh và tỉ lệ bị bệnh hại rễ trong khu vực nghiên cứu
4.1.2. Phân lập mẫu bệnh, giám định sinh vật gây bệnh, mô tả đặc điểm
4.1.2.1. Phân lập mẫu bệnh
Mẫu bẫy đất ngâm được 2 ngày đã xuất hiện vết bệnh trên lá tiến hành kiểm tra dưới kính hiển vi thấy có xuất hiện bào tử nấm bước đầu xác định là nấm Pythium sp. Kết quả này sẽ được chính xác hơn khi đối chiếu với kết quả phân lập trên mẫu bệnh.
Kết quả phân lập trực tiếp từ rễ và phương pháp bẫy đất đều thu được mẫu nấm gây hại trùng nhau. Đặc điểm của sợi nấm gây bệnh là sợi nấm mọc trên mơi trường CMA ít phân nhánh, khơng có vách ngăn. Quan sát hệ sợi nấm trên môi trường dinh dưỡng thấy xuất hiện bào tử áo, sau khi ngâm với nước chiết đất thấy xuất hiện bào tử động và bào tử noãn, kết quả trùng với việc soi trực tiếp ở vết bệnh bẫy được.
4.1.2.2. Kết quả giám định nấm gây bệnh dựa vào đặc điểm của bào tử
Kiểm tra sợi nấm trên kính hiển vi thấy xuất hiện bào tử áo (Chlamydospore) có hình cầu kích thước từ 14,04µ -21,06µ (Hình 4-6), ngâm với nước chiết đất sau 24 giờ thấy xuất hiện Oospore có kích thước trung bình 20,9µ (Hình 4-7). Túi bào tử động hình thn dài khơng có núm, phía đầu dầy lên đây chính là nơi bào tử động sẽ được phóng ra và túi bào tử động có hình quả lê dài từ 18,5µ -20,4µ, rộng từ 13,2µ -15,5µ (Hình 4-8).
Từ một số dữ kiện trên kết hợp với các tài liệu chuyên khảo theo Plaats-Niterink A. J. van der (1981) [57], Yu&Ma (1989) [65] loài là Pythium
vexans de Bary, (1876), thuộc nhóm sinh vật có nhân thật, ngành phụ:
Hình 4-6: Bào tử áo (Chlamydospore) Hình 4- 7: Bào tử nỗn (Oospore)
Hình 4-8: Túi bào tử động (Sporangia) Hình 4-9: Hệ sợi nấm trên mơi trường CMA
Vòng đời Pythium vexans
4.1.2.3. Kết quả giám định nấm gây bệnh dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử
Nấm gây bệnh cho keo được tách AND, chạy phản ứng PCR và giải trình tự. Trình tự nucleotit của AND được xác định như sau:
CCACACCTAAAAACACCCTTCCACGTGAACCGTTTTGTTTTGCTTTC GAGTGCTTTGTTGCGCTCGGAGCATGTTTGGGCTTCGCTGCTGGCG CTTGATTGTGCTGGCGGCTTGAGGCCATCAAGTGGCGTTTTTGAGT GTGCTT-- ACCCATTTGATTGAAAACTGAAGTATACTGTGGGGACGAAAGTCC TCGCTTTGAAACTAGATAACAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCT CGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAA TTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAACTTTTGAACGCATATTGCACT TTCGGGTTACGCCTGGAAGTATGTCTGTATCAGTGTCCGTACACTA AACTTGCGTCTCTTCCGTCGTGTAGTCGTCGGTTGTTTGATTGCAGA TGTGAGGTTGTCTCGCGATCCGTTGCTTGTCAACAAGGTTGCGAGT CCCTTTAAAGTCGGACGCGTG- TTTTTCCGTTTTGTGCTTGATGGGGTGCGGCTGCGGCCGTGTCTGCT GGCGGGTCTGGTGACCTTTGGCGATGGCATAAAAGTGGATTGCTC AATTTGCGGTATGTTAGGCTTCGGCTTTGACAATGCAGCTTATTGT GTATGTTCGCTTGGTTGTTGCTGTATGGGTGAGCTGGATGGTTGGT GGGTGCGTTGTTGCGTGTCGTTTTC- ATGGAGTGCGTTTCGGTTGTCGTCGCCATTTGGGAATTTGTGTTTTC GTAAGAGG---ACATCTCA
So sánh chuỗi AND trên ngân hàng gen thơng qua giao diện tìm kiếm Blast (Basic Local Alignment Search Tool) nấm gây bệnh thối rễ keo được xác định là Pythium vexans de Bary với độ tương đồng 98% so với AND của chủng nấm Pythium vexans ký hiệu AY922975 và AY269998 và độ tương
đồng 97% so với AND của các chủng nấm Pythium vexans, ký hiệu
DQ364465 và AB468803.