2.3.6.1. Chụp X quang phổi
- Tất cả các BN đều được bác sĩ của khoa chẩn đoán hình ảnh Bệnh viện 103 chụp X quang phổi thẳng bằng máy X quang di động hiệu Philips tại giường bệnh ở 5 thời điểm (T0, T1,T3,T5,T7).
- Kỹ thuật chụp:
+ Quay cao đầu bệnh nhân 45-60 độ, hai tay xuôi dọc theo thân người. + Thông số kỹ thuật: Dòng điện 100mA, 3 pha, điện thế 60-80 kv, thời gian chụp 10-60ms, khoảng cách từ bệnh nhân tới bóng Rơnghen là 1,8m, hướng chùm tia X thẳng góc với thân người bệnh nhân.
+ Tiêu chuẩn phim đạt yêu cầu kỹ thuật: Cân đối (đường liên gai mỏm cột sống là đường phân giác của 2 đường nối 2 đầu trong xương đòn), nhìn thấy đốt sống cổ VI-VII ở phía trên, phía dưới thấy 2 góc sườn hoành, hai bên thấy phần mềm lồng ngực, tia chụp phải nhìn thấy 3 đốt sống ngực đầu tiên.
- Đọc và phân tích hình ảnh X quang cùng các bác sĩ chẩn đoán hình ảnh và thầy hướng dẫn.Phân tích tổn thương trên X quang theo trình tự: Vị trí, hình thái, đặc điểm tổn thương và các tổn thương phối hợp.
2.3.6.2. Kỹ thuật lấy dịch phế quản
- Quy trình lấy bệnh phẩm bằng phương pháp mini-BAL được thực hiện theo quy trình đã áp dụng tại Bệnh viện Bạch Mai [23]. Tất cả BN đều được lấy dịch phế quản vào thời điểm T1.
- Lấy bệnh phẩm dịch phế quản theo phương pháp mini-BAL bằng ống thông 2 nòng có nút bảo vệ đầu xa (Aspisafe 2 của hãng Vygon) là ống hút có hai nòng lồng vào nhau, đầu xa của ống có nút bảo vệ làm bằng polyethylen glycol có thể tự tiêu đi khi nằm trong lòng phế quản.
- Chuẩn bị
+ Nghiên cứu sinh trực tiếplấy bệnh phẩmvà tuân thủ theo nguyên tắc vô khuẩn (Đội mũ, đeo khẩu trang, rửa tay đi găng vô trùng).
39
+ Dùng ống polyethylen glycol của hãng Vygon – Cộng hòa Pháp.
- Cách tiến hành lấy bệnh phẩm bằng phương pháp mini-BAL: Đưa ống thông hai nòng qua ống NKQ, hướng vào bên phổi nghi ngờ tổn thương trên phim X quang bằng cách hướng ống thông vào bên đó và quay đầu BN về bên đối diện. Độ dài ống thôngcần phảiđưa vào phế quản bằng chiều dài ống NKQ thêm 10cm nữa, sau đó đẩy nòng trong của ống ra. Dùng bơm tiêm bơm vào phế quản 20 ml dung dịch nước muối sinh lí rồi hút ra 2-5 ml. Sau đó rút nòng trong ra 5 cm. lúc này nòng trong được nòng ngoài của che kín, rồi rút cả hai nòng ra. Tiếp theo, khi đã ra ngoài, rút nòng trong ra, rồi dùng bơm tiêm bơm số dịch đã hút vào ống nghiệm vô khuẩn. Chuyển bệnh phẩm đến khoa xét nghiệm vi sinh bệnh viện 103 trong vòng 30 phút [23].
Hình 2.1: Nghiên cứu sinh thực hiện lấy bệnh phẩm dịch phế quản bằng dụng cụ Aspisafe 2 của hãng Vygon tại khoa HSTC Bệnh viện 103 2.3.6.3. Nuôi cấy và định lượng vi khuẩn
Xét nghiệm nuôi cấy và định lượng vi khuẩn trong dịch phế quản được thực hiện tại khoa Vi sinh Bệnh viện 103.
- Dịch rửa phế quản được lấy với số lượng từ 2 – 5ml đựng trong ống nghiệm vô khuẩn để ở nhiệt độ phòng 18 – 250
40
- Các môi trường nuôi cấy: Bao gồm thạch máu, thạch Chocolate và MacConkey được bảo quản ở 2 – 80C trong giấy bọc vô trùng. Để ở nhiệt độ phòng 15 phút trước khi sử dụng.
- Các bước thực hiện
+ Làm tiêu bản nhuộm Gram phát hiện hình thể những vi khuẩn gây bệnh gồm tụ cầu, liên cầu, song cầu Gramdương (xung quanh có khoảng sáng), song cầu Gramâm (nằm cả trong và ngoài tế bào), trực khuẩn Gram âm:(Trực khuẩn đường ruột hoặc trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn nhỏ).
+ Cấy khuẩn: Cấy 3 đĩa môi trường theo thường quy (cấy phân vùng). Môi trường thạch Chocolate để tủ ấm 370C có 5 – 7% CO2. Môi trường thạch máu: Sau khi cấy dùng loop cắm sâu xuống thạch mỗi vùng 3 điểm để xác định tan máu beta, ủ ấm 370C có 5 - 7% CO2. Môi trường MacConkey: Xác định vi khuẩn đường ruột, để tủ ấm 370
C.
+ Cấy định lượng: Dùng một đĩa thạch máu và một đĩa thạch chocolate. Dùng loop định lượng cấy ria đều lên mặt đĩa, ủ ấm 370C có 5 - 7% CO2 trong 24h. Đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn mọc trên cả 2 đĩa thạch.
- Đọc kết quả: Nhận định kết quả sau 24 giờ.
+ Nếu không thấy vi khuẩn mọc thì để tiếp vào tủ ấm đến 48 giờ ghi phiếu trả kết quả, đĩa thạch giữ đến 72 giờ sau.
+ Nếu có nghi ngờ thì phải để đến 7 ngày.
+ Nếu có vi khuẩn mọc: Quan sát kỹ hình thái khuẩn lạc, tính chất tan máu, nhuộm xem hình thể và tính chất bắt màu để chẩn đoán phù hợp.
+ Số lượng vi khuẩn là số khuẩn lạc trong 1ml (Colony Forming Unit).
2.3.6.4. Kỹ thuật làm kháng sinh đồ
Xác định độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng phân lập được theo phương pháp khoanh giấy khuếch tán trong thạch - Kĩ thuật Kirby Bauer.
+ Dùng que cấy lấy 5-10 khuẩn lạc, nghiền vào nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều.
41
+ So sánh với độ đục chuẩn Mc Farland 0,5 hoặc máy so độ đục để được hỗn dịch vi khuẩn tương đương 108 vi khuẩn/ml.
+ Dùng que tăm bông nhúng vào hỗn dịch vi khuẩn và ria cấy đều trên mặt thạch. Chờ cho se mặt thạch.
+ Đặt các khoanh giấy kháng sinh phù hợp với từng loài vi khuẩn lên bề mặt thạch. Khoảng cách giữa các khoanh ≥ 20 mm, cách thành đĩa ≥15mm.
+ Để đĩa thạch 30 phút ở nhiệt độ phòng cho kháng sinh khuyếch tán, sau đó để tủ ấm 370
C từ 18 - 24 giờ sau đó đọc kết quả.
+ Đọc kết quả: Đo đường kính vùng ức chế bằng thước mm.
+ Đánh giá kết quả: Đối chiếu với bảng giới hạn đường kính vùng ức chế cho từng loại kháng sinh của hãng sản xuất để xác định mức độ nhạy cảm (S), trung gian (I) hay đề kháng (R).
+ Các chủng thử nghiệm luôn được làm song song với chủng mẫu.
Hình 2.2: Đĩa làm kháng sinh đồ tại khoa vi sinh Bệnh viện 103 2.3.6.5. X t nghiệm huyết học và sinh h a máu
- Các BN đều được lấy máu 5 lần (T0, T1,T3,T5,T7).
- Xét nghiệm huyết học được thực hiện tại khoa Huyết học Bệnh viện 103, các chỉ tiêu bao gồm: Số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, huyết sắc tố (Hb), Hematocrit, tiểu cầu. Xét nghiệm trên máy Becman Coulter LH 780. Đánh giá theo tiêu chuẩn của Đỗ Trung Phấn và cs [13].
42
- Xét nghiệm sinh hóa máu được thực hiện tại khoa Sinh hóa Bệnh viện 103, các chỉ tiêu bao gồm: Nồng độ glucose, hàm lượng protein, albumin, nồng độ ure, creatinin, AST, ALT, nồng độ các chất điện giải (Na+, K+,Cl, Ca2
+) Trên máy OLYMPUS AU640. Đánh giá các tiêu chuẩn theo Nguyễn Đạt Anh và Nguyễn Thị Hương [1].
2.3.6.6. Định lượng nồng độ Protein C phản ứng trong máu.
- Xét nghiệm CRP 5 lần (T0, T1,T3,T5,T7), trên máy OLYMPUS AU640. - Nguyên lí: CRP được định lượng bằng phương pháp miễn dịch đo độ đục (Turbidimetric immunoassay) dùng kít chạy trên máy Au 640 (Beckman Coulter). Kháng thể kháng CRP kết hợp với kháng nguyên CRP trong bệnh phẩm tạo thành phức hợp kháng nguyên - kháng thể làm đục dung dịch. Mức độ đục tỷ lệ thuận với nồng độ CRP. Đo độ đục ở bước sóng 340 nm, so với dung dịch chuẩn để tính kết quả.
- Quy trình kỹ thuật:
+ Mẫu: Lấy 2ml máu chống đông bằng heparin.
+ Thuốc thử: Bao gồm dung dịch đệm glycin 100mmol/L, Latex gắn kháng thể kháng CRP:<0.5% (W/V) và dung dịch chuẩn Olympus CRP.
+ Trộn 150 μl thuốc thử 1 với 2 μl huyết tương. Ủ trong 5 phút. + Thêm 150 μl thuốc thử 2 ủ trong 10 phút.
+ Đo mật độ quang họcở bước sóng 570 nm. + Tính toán kết quả theo công thức:
Chú thích: Et là mật độ quang của mẫu thử. EB là mật độ quang của mẫu trắng. Es là mật độ quang của mẫu chuẩn. C là nồng độ mẫu bệnh phẩm cần xét nghiệm, Cs là nồng độ của mẫu chuẩn.
C =
Et - EB
Es - EB
43
Hình 2.3: Máy x t nghiệm sinh h a OLYMPUS AU640 tại Bệnh viện 103 2.3.6.7. Định lượng nồng độ Procalcitonin trong huyết thanh
- Lấy máu xét nghiệm PCT 5 lần (T0, T1,T3,T5,T7), trên máy Cobas e411. Định lượng nồng độ PCT theo phương pháp Elecsys BRAHMS PCT.
- Nguyên lí: Elecsys BRAHMS PCT là một phản ứng miễn dịch điện hóa phát quang dựa vào nguyên lí Sandwich để định lượng PCT trong máu.
Đây là loại xét nghiệm có độ nhậy cao hơn ELISA. Kỹ thuật điện hóa phát quang (ECL: Electrode Chemi Luminescence) sử dụng chất đánh dấu Ruthenium khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học, vì vậy có khả năng phát hiện chất có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh chỉ trong vòng 18 – 20 phút. Các kháng thể (hoặc kháng nguyên) gắn Biotin và chất đánh dấu Ruthenium cùng vi hạt phủ Streptavidin được ủ trong hỗn hợp phản ứng. Khi đặt một điện thế lên điện cực buồng đo, phức hợp ruthenium được kích hoạt và tín hiệu phát quang được hình thành. Tín hiệu được đo và kết quả xét nghiệm được xác định qua đường chuẩn xét nghiệm đã được thiết lập.
44
Hình 2.4: Nguyên lý phát hiện phức hợp kháng nguyên-kháng thể của kỹ thuật điện h a phát quang
*Nguồn: Theo Forster R. J. (2009)[64].
- Quy trình:
+ Mẫu: Lấy 2ml máu chống đông hoặc không chống đông. + Pha loãng dung dịch theo tỷ lệ 1:100.
+ Ủ lần 1: Lấy 30l mẫu huyết thanh có chứa PCT kết hợp với kháng thể đơn dòng kháng PCT gắn Biotin và kháng thể này được đánh dấu bằng hợp chất Ruthenium sẽ phản ứng tạo thành phức hợp Sandwich.
+ Ủ lần II: Sau khi thêm các vi hạt phủ Streptavidine, phức hợp trở thành pha rắn thông qua sự tiếp xúc giữa biotin và Streptavidine.
+ Hỗn hợp phản ứng được hút vào buồng đo bởi từ tính trên bề mặt của điện cực. Các chất tự do bị loại bỏ bởi Procell. Sự gắn điện thế vào điện cực gây ra sự phát quang bằng phản ứng hóa học và đo bằng máy đọc điện quang.
+ Tính toán: Thông qua đường cong định chuẩn được tạo ra bởi 2 điểm Calibrator và đường cong ROC được cung cấp bằng Barcode.
- Đọc kết quả: Thiết bị phân tích tự động sẽ tính toán nồng độ của mẫu ra đơn vị ng/mL. Giới hạn đo: 0,02-100 ng/mL. Ở ngưỡng <0,5 ng/mL thì nguy cơ
45
thấp đối với nhiễm khuẩn nặng hoặc shock nhiễm khuẩn. Ở ngưỡng >2 ng/mL thì nguy cơ cao nhiễm khuẩn nặng hoặc shock nhiễm khuẩn.
Hình 2.5: Máy Cobas e411 định lượng Procalcitonin tại Bệnh viện 103