- Lên men và thu hồi nisin: Sử dụng hệ thống bình lên men 5, 10 l, 100 l và các thiết bị
2.2.1. Phƣơng pháp xác định hoạt tính nisin
Để lựa chọn chủng có hoạt tính tổng hợp nisin cao trong bộ sưu tập của Phòng, dựa trên đánh giá tác dụng ức chế chủng kiểm định L. plantarum JCM1149 [8]. Hoạt tính kháng khuẩn của nisin được xác định bằng phương pháp khuếch tán trong mơi trường thạch có cải tiến theo Phan K.H và cs [8], gồm một số bước:
Bước 1: Chủng kiểm định L. plantarum JCM 1149 được nuôi tĩnh qua đêm (12 giờ)
trong môi trường MRS lỏng ở 30 °C (OD600 = 1,28).
Bước 2: Mơi trường MRS bán lỏng (có chứa 0,6 % thạch) được khử trùng ở 121 °C, 15 phút. Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ khoảng 37 ÷ 40 °C, bổ sung 0,5 % (v/v) dịch huyền phù vi khuẩn chủng kiểm định, lắc đều và đổ ra đĩa petri có đường kính 15 cm (20 ml/đĩa). Đợi thạch nguội, đục giếng. Mỗi giếng có đường kính 7 mm.
Bước 3: Hút 25 µl dịch nisin đã được pha loãng nhỏ vào các giếng thạch và giữ ở nhiệt độ 4 oC trong khoảng 4 giờ, sau đó ủ ở 37 oC qua đêm. Quan sát và đo đường kính vịng vơ khuẩn được hình thành. Trong đó, đường kính vịng vơ khuẩn của mẫu nghiên cứu bằng hiệu của đường kính vịng vơ khuẩn đo được và đường kính giếng thạch (D- d). Căn cứ vào việc xuất hiện vịng vơ khuẩn và kích thước đường kính vịng vơ khuẩn để xác định hoạt tính nisin của chủng nghiên cứu.
Hoạt tính của nisin thường được xác định bằng đơn vị quốc tế IU (International Unit). Việc xác định cơ bản dựa theo phương pháp của Fowler và cộng sự đề xuất 1975.. Chủng kiểm định là L. plantarum JCM1149 một chủng kháng axit và nhạy cảm với nisin. Nisin chuẩn của hãng Sigma với hoạt tính 1000000 IU/g được pha thành các nồng độ khác nhau. Xác định hoạt tính của những mẫu này bằng cách đo đường kính vùng ức chế đối với L. plantarum. Từ đó lập phương trình đường chuẩn tương quan giữa nồng độ nisin (tính bằng IU/ml hoặc IU/mg) và đường kính vịng ức chế bằng phần mềm Excel của Microsoft, phương trình có dạng hàm số mũ: Y = 102.5 x e 0.281x
, hệ số hồi quy R2 = 0.994. Trong công thức này: x = D-d (mm), D: là đường kính vịng vơ khuẩn (mm) , d: là đường kính lỗ khoan (mm);, Y: Hoạt tính chế phẩm (IU/ml hoặc IU/mg) .
29
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Với đường cong chuẩn đã dựng được, việc xác định hoạt tính các mẫu chứa nisin rất thuận lợi và nhanh chóng (hình 2.1).
Hình 2.1. Đường cong chuẩn xác định nồng độ nisin (IU) 2.2.2. Phƣơng pháp tạo màng PLA - nisin
Màng PLA - nisin được chuẩn bị theo phương pháp của T. Jin và cộng sự [46]. Cân 0,75 g PLA bổ sung vào bình tam giác nút nhám chứa 25ml DMCL. Dung dịch được khuấy cho đến khi tan hoàn toàn. Khi dung dịch trong suốt bổ sung 0,25 g nisin và tăng khuấy. Sau đó, hỗn hợp trên được đổ ra đĩa petri có đường kính 15 cm. Dung dịch methylene chloride được bay hơi ở nhiệt độ phòng trong tủ hút.