mỗi điều kiện. Kết quả cho thấy lượng rapamycin thu được trong môi trường không có Glycerol thấp hơn so với môi trường có Glycerol, lượng rapamycin thu được cao nhất là 0,734 mg/g trong môi trường có 80 g/L tinh bột, 74,89 g/L Glycerol và 4,5 g/L NaCl. Trong quá trình nuôi cấy chủng xạ khuẩn, glycerol thường được bổ sung vào môi trường cùng với các loại đường khác như dextrin, glucose, maltose nhằm tăng quá trình lên men, sinh tổng hợp các chất thứ cấp. Hiếm khi lựa chọn Glycerol là nguồn cung cấp năng lượng duy nhất bởi nó là chất cung cấp nhiều năng lượng, tế bào sẽ liên tục tăng sinh chất chuyển hóa bậc một nên các chất chuyển hóa bậc hai sinh ra rất ít.
Tóm lại, có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới các chất chuyển hóa bậc hai. Trong đường cong sinh trưởng của vi sinh vật, ban đầu các tế bào cần một nguồn năng lượng, nguồn Cacbon ổn định để tổng hợp các chất sơ cấp cần thiết cho tế bào tăng sinh. Sau đó, pha lên men cần các chất xúc tác gây ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chất thứ cấp. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn hai thành phần môi trường là Glycerol và bột Hồi (chứa axit shikimic) để khảo sát tới lượng rapamycin thu được.
1.4.2. Các nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến làm tăng lượng rapamycin rapamycin
Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu khoa học nhằm tạo các chủng xạ khuẩn đột biến có khả năng sinh rapamycin cao. Một số nghiên cứu sử dụng đột biến ngẫu nhiên để tạo chủng đột biến. Nhóm nghiên cứu của Dutta và Basak đã tạo chủng xạ khuẩn đột biến NTG-30-27 từ chủng Streptomyces hygroscopicus MTCC 4003 bằng tia cực tím (UV) và hóa chất gây đột biến N-methyl-N-nitro_N-nitrosoguanidin (NTG) [12]. Lượng rapamycin thu được từ chủng NTG-30-27 cao hơn 67% so với chủng đối chứng. Bào tử chủng xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253 được chiếu tia UV để tạo chủng xạ khuẩn đột biến có khả năng sinh rapamycin tăng 3,2 lần (23,6 mg/L) so với chủng hoang dại [22]. Các nghiên cứu sử dụng phương pháp đột biến ngẫu nhiên cần có nhiều thời gian để sàng lọc, kiểm tra hoạt tính kháng
lớn nhất và định lượng rapamycin để tìm được chủng xạ khuẩn đột biến có khả năng sinh rapamycin cao nhất.
Bên cạnh đó, các nghiên cứu về gen và cụm gen đã xác định chức năng của các gen trong vùng điều hòa quá trình sinh tổng hợp rapamycin. Bằng phương pháp lai phân tử, xác định vai trò của RapA, RapB, RapC, RapP là yếu tố mở đầu quá trình tổng hợp chuỗi polyketide [46]. Ngoài ra, các gen ngoài vùng này cũng được quan tâm nghiên cứu bởi ảnh hưởng tích cực và tiêu cực của nó đến quá trình sinh tổng hợp rapamycin. Kuscer Enej và Coates Nigel (2007) đã chứng minh gen rapH và gen
rapG là gen điều hòa dương trong quá trình tổng hợp rapamycin bằng đột biến tăng
cường biểu hiện, mất đoạn gen [29]. Các chủng xạ khuẩn thêm bản copy gen rapG hoặc rapH hoặc cả hai đều cho lượng rapamycin cao hơn từ 20% - 55% so với chủng hoang dại, khi xóa cả hai gen rapG và gen rapH không thể định lượng rapamycin. Tuy nhiên, cơ chế điều hòa quá trình sinh tổng hợp rapamycin của rapG và rapH còn chưa được làm rõ. Một nghiên cứu khác của Yoo (2015) về các gen điều hòa quá trình sinh tổng hợp rapamycin đã chứng minh gen rapS-R và rapY là gen điều hòa âm . Khi lần lượt tạo đột biến mất đoạn gen rapS và rapY, hiệu suất rapamycin tăng thêm 4,6 lần (33,9 mg/L) và 3,7 lần (26,7 mg/L) so với chủng hoang dại.
Như vậy, việc cải biến di truyền tác động vào quá trình điều hòa sinh tổng hợp rapamycin ở S. rapamycinicus hứa hẹn khả năng tạo ra các chủng có hiệu suất sinh rapamycin tăng cao. Đó cũng là tiền đề cơ bản để chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu được trình bày trong luận văn này.
Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy
Chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus DSM41530 được cung cấp từ Bảo tàng vi sinh vật và tế bào, Viện Leibniz, Đức.
Các chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5α và ET12567/pUZ8002 được cung cấp bởi phòng Nghiên cứu và phát triển công nghệ, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Chủng nấm men Candida albicans VTCC 40674 do Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học cung cấp.
Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1
Bảng 2.1. Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật STT Ký hiệu môi trường Thành phần môi trường (g/L)
1 LB Cao nấm men 5 NaCl 10
Peptone 10 pH 7,0
2 YS Cao nấm men 2 Agar 16
Tinh bột 10
3 YM
Glucose 3 Cao Malt 3
Peptone 5 Cao nấm men 3 4 MD1 Dextrin 40 NaCl 5 L – Lysine HCl 2 pH 5,0 Đậu tương 30 Na2HPO4 3 5 MD2 Glucose 20 KH2PO4 5 Đậu tương 20 pH 6,0 6 MD3 Glucose 6 K2HPO4 0,025
(NH4)2SO4 0,2 pH 6,5 7 MS Manitol 20 Đậu tương 20 MgCl2 10mM 8 ISP2 Cao Malt 10 Cao nấm men 4 Glucose 4 2.1.2. Vector và oligonucleotide
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector nhân dòng: pGEM-T Easy Vector (Promega, Mỹ). Vector chuyển gen pSET152 được cung cấp bởi phòng Nghiên cứu và Phát triển công nghệ cao, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học.
Các cặp oligonucleotide (Bảng 2.2.) được thiết kế để nhân các đoạn gen đích dựa trên trình tự công bố trên Ngân hàng gen NCBI (X86780.1). Primer được tổng hợp bởi Integrated DNA Technologies (Mỹ) và Primer Diagnosis Healthcare (Việt Nam). Trình tự primer được thể hiện trong bảng 2.2.
Probe sử dụng trong lai Southern Blot chứa đoạn trình tự gen rapG có gắn đầu dò phóng xạ P32 được tổng hợp bởi Merk, Đức.
Bảng 2.2. Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự Gen/Kích
thước prapGF 5’- GGTCTAGAACCAACGGCGCTGGAGCGGA G - 3’ rapG/ 1.0 kb prapGR 5’- GGTCTAGAGGTCAGCTGTCGGTCAGCCC GGTTG-3’ M13F(-29) 5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’ Kích thước gen thêm vào M13R(-20) 5’-GCGGATAACAATTTCACACAGG-3’
2.1.3. Hóa chất và thiết bị
Trong nghiên cứu này, các hóa chất sinh học phân tử như enzyme giới hạn gồm XbaI, EcoRI, HindIII (Thermo Scientifics, Mỹ), enzyme DNA T4 Ligase, thang chuẩn ADN (300 bp-10 kb) (Thermo Scientifics, Mỹ), Taq polymerase Go Taq (Promega, Mỹ), Kit tinh sạch plasmid DNA-spin™ Plasmid DNA Purification Kit (Intron, Hàn Quốc), kit E.N.Z.A Bacterial DNA kit (Omega, Mỹ), kit tinh sạch sản phẩm PCR: AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc) được sử dụng, đảm bảo tính chính xác của các thí nghiệm.
Các loại kháng sinh ampicillin (Wako, Nhật Bản), apramycin (Sigma, Mỹ) được sử dụng trong các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật.
Các hóa chất pha môi trường, dung dịch đệm, dung dịch rửa cho các thí nghiệm được cung cấp bởi Sigma (Mỹ).
Thiết bị máy móc gồm : Máy PCR Mastercycler proS của hãng Eppendorf (Đức), hệ thống điện di của hãng Cleaver Scientific (Mỹ), bàn soi UV Benchtop Variable Transilluminator (Mỹ), hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) của hãng Agilent (Mỹ). Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy thông thường như tủ an toàn sinh học cấp II Esco Labculture kiểu A2 (Mỹ), nồi hấp khử trùng HV Hirayama HV (Nhật Bản), tủ lắc ổn nhiệt Gyromax 747R của hãng Amerex Instruments (Mỹ) và một số thiết bị chuyên dụng khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chung
Để thực hiện mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành tạo chủng xạ khuẩn theo các bước sau (Hình 2.1):
- Thiết kế vector gây đột biến - Tạo chủng xạ khuẩn chuyển gen - Kiểm tra chủng xạ khuẩn chuyển gen
Hình 2.1. Phương pháp tạo chủng đột biến
Sau khi có chủng xạ khuẩn chuyển gen, tiến hành nuôi các chủng xạ khuẩn trong các môi trường nuôi cấy khác nhau nhằm định lượng khả năng sinh rapamycin theo sơ đồ sau:
2.2.2. Phương pháp tách ADN
2.2.2.1. Tách chiết plasmid
Plasmid được tách từ tế bào vi khuẩn bằng bộ kit DNA-spin™ Plasmid DNA Purification Kit (Intron) theo các bước sau:
1. Tế bào vi khuẩn mang plasmid được nuôi trong 5 mL môi trường LB dịch thể có bổ sung kháng sinh Apramycin 50 mg/L, nuôi lắc 160 rpm, qua đêm, 37°C. Ly tâm với vận tốc 8000 rpm, 5 phút, nhiệt độ phòng, bỏ dịch và thu phần sinh khối tế bào.
2. Bổ sung 250 µL dung dịch đệm 1 (Resuspension Buffer) đã thêm RNase vào sinh khối, vortex để tế bào hòa lẫn vào dung dịch đệm. Thêm 250 µL dung dịch 2 (Lysis Buffer) vào hỗn hợp trên, đảo nhẹ ống và ủ trong 3 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm 350 µL dung dịch 3 (Neutralization Buffer), đảo ống nhẹ nhàng và ủ trên đá 5 phút.
4. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 rpm, 10 phút, 4°C để các mảnh vỡ tế bào và protein biến tính lắng xuống đáy ống. Dịch nổi sau ly tâm được đưa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 13000 rpm, 1 phút. Plasmid được giữ trên lớp màng của cột tinh sạch, bỏ phần dịch qua cột.
5. Rửa plasmid với 500 µL đệm rửa (Washing Buffer A) và ly tâm 13000 rpm trong 1 phút, bỏ phần dịch qua cột. Tiếp tục rửa plasmid với 700 µL đệm rửa (Washing Buffer B), 13000 rpm trong 1 phút, bỏ phần dịch qua cột. Có thể lặp lại thêm một lần bước rửa plamid với Washing Buffer B để tăng độ sạch của mẫu. Ly tâm cột 13000 rpm trong 1 phút để làm khô màng cột.
6. Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 mL mới. Bổ sung 50-100 µL dH2O vào chính giữa màng cột, ủ cột trong bể ổn nhiệt 65°C trong 10 phút, ly tâm 10000 rpm, 1 phút. Mẫu plasmid tinh sạch được bảo quản ở -20°C.
2.2.2.2. Tách chiết ADN tổng số
Chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus DSM 41530 và các chủng xạ khuẩn khác được nuôi trong môi trường ISP2 dịch thể để thu tế bào và tách ADN tổng số bằng bộ kit E.N.Z.A Bacterial DNA kit (Omega) theo các bước sau:
1. Chủng xạ khuẩn được nuôi trong môi trường dịch thể ISP2, 3 ngày, 160 rpm, 30°C để tăng lượng sinh khối. Thu 3-5 mL dịch nuôi, ly tâm 8000 rpm, 5 phút để thu sinh khối.
2. Thêm 100 µL đệm TE, vortex đến khi hòa đều sinh khối vào dung dịch đệm. Bổ sung 10 µL Lysozyme 50 mg/mL và ủ trong bể ổn nhiệt 37°C, 2 giờ.
3. Thêm 100 µL dung dịch đệm TL và 20 µL Protein K, vortex mạnh, ủ 55°C trong bể ổn nhiệt, 1 giờ, 20-30 phút đảo ống một lần. Thêm 5 µL RNase, đảo ống 10 lần và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm hỗn hợp trên 10000 rpm, 2 phút để các mảnh tế bào lắng xuống đáy ống.
4. Chuyển toàn bộ phần nổi sang ống Eppendorf 1,5 mL mới, thêm 220 µL dung dịch đệm BL, vortex mạnh và ủ trong 65°C, 10 phút. Sau đó, bổ sung 220 µL ethanol 96%, vortex 20 giây.
5. Chuyển toàn bộ hỗn hợp lên cột, ly tâm 10000 rpm, 1 phút, bỏ phần dịch qua cột. Thêm 500 µL dung dịch HBC và ly tâm 10000 rpm trong 1 phút, bỏ dịch qua cột. Rửa cột với 700 µL DNA Wash Buffer, ly tâm 10000 rpm trong 1 phút, bỏ dịch. Có thể lặp lại thêm một lần bước rửa cột với DNA Wash Buffer. Ly tâm cột 13000 rpm, 2 phút để làm khô cột.
6. Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 mL mới, bổ sung 50-100 µL dH2O vào chính giữa màng cột, ủ cột trong bể ổn nhiệt 65°C, 10 phút. Ly tâm 10000 rpm, 1 phút. Mẫu ADN tổng số được bảo quản ở -20°C.
2.2.3. Phương pháp biến nạp
Phương pháp biến nạp được thực hiện để chuyển plasmid vào tế bào khả biến – là những tế bào có khả năng nhận ADN lạ từ ngoài vào trong tế bào. Trong nghiên cứu này, các sản phẩm nối được biến nạp vào các tế bào khả biến E. coli DH5α, vector gây đột biến biến nạp vào tế bào khả biến E. coli ET12567/pUZ8002.
Tạo tế bào khả biến: Chủng E. coli DH5α được nuôi trong môi trường dịch
thể LB. Chủng E. coli ET12567/pUZ8002 được nuôi trong 5 mL dịch thể LB có bổ sung chloramphenicol 25 mg/L, kanamycin 50mg/L, nuôi lắc 120 rpm qua đêm ở 37°C. Sau đó, 500 µL dịch nuôi được chuyển sang nuôi cấy trong 50 mL môi trường
LB, ở 37°C, 120 rpm đến khi đạt OD600 khoảng 0,3–0,4. Dịch nuôi được giữ ở 4°C trong 5 phút và chuyển sang ống falcon 50 mL. Tế bào được thu bằng cách ly tâm với tốc độ 5000 rpm trong 10 phút ở 4°C và bỏ dịch sau ly tâm. Bổ sung 50 mL dung dịch CaCl2 0,05 M (đã giữ ở 4°C), trộn đều bằng pipet và ủ mẫu ở 4°C trong 30 phút. Dịch được loại bỏ bằng ly tâm với tốc độ 5000 rpm trong 10 phút, 4°C. Thêm 10 mL hỗn hợp CaCl2 (lạnh) 0.05 M pha trong glycerol 15%, trộn đều bằng pipet. Lấy 200 µL hỗn hợp cho vào ống eppendorf và làm lạnh nhanh trong nito lỏng. Bảo quản các ống trong tủ lạnh sâu (- 80°C).
Phương pháp biến nạp: Plasmid tách bằng kit được trộn đều với 100 µL tế
bào khả biến bằng pipet và giữ trong đá lạnh 20 phút. Sau đó, cho hỗn hợp tế bào và plasmid vào bể ổn nhiệt ở 42°C trong 45 giây. Lấy ống phản ứng cho vào đá lạnh 3 phút. Tế bào sau khi sốc nhiệt được nuôi trong 1 mL môi trường LB dịch thể, nuôi lắc 160 rpm trong 2 giờ ở 30°C. Trải dịch lên đĩa thạch LB có bổ sung kháng sinh hoặc chất chỉ thị chọn lọc thích hợp. Đĩa pepetri được ủ ở 37°C trong 24 giờ. Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.
2.2.4. Phương pháp tạo dòng vector pSET152/ rapG
Đoạn gen rapG được khuếch đại bằng phương pháp PCR từ ADN của chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus DSM41530 và cặp mồi cho gen rapG (Bảng 2.2). Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt: 95°C- 5 phút; (95°- 30 giây, 62°C- 15 giây, 72°C- 1 phút 30 giây) × 30 chu kỳ; 72°C- 7 phút. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên agarose 1% với hiệu điện thế 100V trong 20 phút. Kích thước rapG trên bản gel được kiểm tra dựa vào thang chuẩn ADN.
Sản phẩm PCR của gen rapG được tinh sạch bằng kit AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc). Nồng độ và chất lượng ADN được kiểm tra bằng nanodrop trước khi thực hiện phản ứng cắt với enzyme giới hạn XbaI. Hỗn hợp cắt gồm 17 µL sản phẩm PCR của rapG sau tinh sạch, 2 µL Buffer, 1µL XbaI được ủ ở 37°C trong 2 giờ. Trong một phản ứng độc lập, plasmid pSET152 sau khi được kiểm tra chất lượng và nồng độ được cắt với XbaI. Sản phẩm cắt được kiểm tra bằng điện di trên agarose 1%. Sản phẩm cắt đúng kích thước được tinh sạch sử dụng kit AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc).
Phản ứng nối được thực hiện gồm: 7 µL H2O, 2 µL plasmid pSET152 đã cắt, 10 µL rapG đã cắt, T4 Buffer 2 µL, T4 Ligase 1 µL, hỗn hợp ủ ở 22°C qua đêm. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và trải trên môi trường LB bổ sung kháng sinh apramycin 50 mg/L, IPTG 1M, X-gal 20mg/L. Những khuẩn lạc của tế bào mang plasmid pSET/rapG có màu trắng trên môi trường chọn lọc. Các khuẩn lạc màu trắng được kiểm tra bằng cách PCR với mồi M13F và M13R. Khuẩn lạc sau khi được kiểm tra sẽ chuyển sang nuôi trên môi trường dịch thể LB và giữ chủng ở -80°C. Đồng thời, tách plasmid từ khuẩn lạc được chọn để lưu trữ plasmid và chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.5. Phương pháp tiếp hợp
Plasmid pSET152/rapG được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng
ET12567/pUZ8002 và được sàng lọc trên môi trường LB thạch bổ sung apramycin 50 mg/L, chloramphenicol 25 mg/L, kanamycin 50 mg/L. Phương pháp tiếp hợp thực hiện giữa vi khuẩn E. coli ET12567/pUZ8002 mang vector pSET152/rapG và bào tử chủng xạ khuẩn S. rapamycinicus DSM 41530. Quy trình thực hiện như sau:
1. Xử lý tế bào vi khuẩn E. coli chủng ET12567/pUZ8002 mang vector
pSET152/rapG: Chủng vi khuẩn được nuôi lắc trong 5 mL LB dịch thể bổ sung kháng sinh apramycin 50 mg/L, chloramphenicol 25 mg/L, kanamycin 50 mg/L, 37°C, 160 rpm nuôi qua đêm. Bổ sung 500 µL dịch nuôi vào 50 mL LB mới, nuôi lắc 3-4 giờ để OD600 đạt 0,5. Ly tâm 3500 rpm, 5 phút, bỏ dịch nuôi thu sinh khối. Sau đó, rửa tế