Gen rapG được khuếch đại từ genome chủng xạ khuẩn S. rapamycinicus DSM 41530 và sản phẩm PCR gen rapG có kích thước khoảng 1,0 kb (Hình 3.1.). Sản
phẩm PCR của gen rapG sau khi tinh sạch đạt nồng độ 72.3 ng/µl với tỉ lệ A260/280 là 1,9; tỉ lệ A260/230 là 1,8. Do đó, mẫu rapG sau tinh sạch đủ về lượng và chất để làm các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1. Sản phẩm PCR gen rapG trên agarose
Trên môi trường chọn lọc LB thạch bổ sung ampicillin 50 mg/L, IPTG 1M và X-gal 20 mg/L, thấy xuất hiện các khuẩn lạc mang vector tạo dòng pGEM/rapG màu trắng và các khuẩn lạc mang vector pGEM tự đóng vòng có màu xanh (Hình 3.2.). Vector pGEM đóng vòng mang gen kháng kháng sinh ampicillin và gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase phân giải cơ chất X-gal thành màu xanh, do đó các khuẩn lạc này mọc được trên môi trường có kháng sinh và có màu xanh. Vector pGEM/rapG mang gen kháng kháng sinh ampicillin và vùng gen lacZ bị gián đoạn bởi đoạn gen
rapG được chèn thêm vào, do đó khuẩn lạc mang pGEM/rapG mọc được trên kháng
Hình 3.2. Các khuẩn lạc xanh-trắng mang vector pGEM/rapG
và pGEM đóng vòng trên môi trường chọn lọc
Kết quả PCR khuẩn lạc với cặp mồi M13F và M13R của vùng liên gen trong plasmid cho thấy trong số 9 khuẩn lạc trắng được chọn có 3 khuẩn lạc kí hiệu 1, 4 và 9 cho kết quả điện di băng sáng kích thước 1,0 kb (Hình 3.3). Sản phẩm PCR đối chứng âm là khuẩn lạc xanh không cho băng sáng nào. Kích thước sản phẩm PCR các khuẩn lạc này bằng với kích thước gen rapG đã công bố, do đó chúng tôi cho rằng đã tạo được plasmid pGEM/rapG.
Hình 3.3. Sản phẩm PCR bằng mồi M13F và M13R các khuẩn lạc trắng
Sản phẩm cắt plasmid pGEM/rapG cho thấy hai băng sáng có kích thước 3,0 kb và 1,0 kb, tương ứng với kích thước plasmid pGEM và gen rapG (Hình 3.4 (A). Đồng thời, sản phẩm cắt plasmid pSET 152 cho một băng sáng có kích thước 5,5 kb
và plasmid pSET152 sau cắt, chúng tôi thấy rằng nồng độ của rapG sau cắt là 27
ng/µl và nồng độ plasmid pSET152 sau cắt là 112,7 ng/µl, các chỉ số A280/230 và A260/230 nằm trong khoảng 1,8-2,0. Do đó, các mẫu rapG sau cắt và pSET 152 sau cắt đủ điều kiện về lượng và chất để tham gia vào phản ứng nối tiếp theo.
Hình 3.4. Sản phẩm cắt plasmid pGEM/rapG (A) và pSET152 (B)
Khi biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả biến E. coli DH5α, chúng tôi thấy xuất hiện 04 khuẩn lạc trắng và nhiều khuẩn lạc xanh mọc trên bề mặt môi trường chọn lọc. Các khuẩn lạc trắng mang plasmid pSET152/rapG có gen kháng kháng sinh apramycin và vùng gen lacZ bị gián đoạn bởi gen rapG chèn thêm vào nên các khuẩn lạc này mọc được trên môi trường có bổ sung apramycin và có màu trắng. Các khuẩn lạc xanh mang plasmid pSET152 tự đóng vòng có gen kháng kháng sinh apramycin và gen lacZ, do đó các khuẩn lạc này mọc được trên môi trường có kháng sinh và phân hủy được cơ chất X-gal tạo màu xanh. Kiểm tra 04 khuẩn lạc trắng với cặp mồi M13F và M13R cho thấy: sản phẩm PCR khuẩn lạc số 01, 02, 03 cho băng sáng rõ nét kích thước 1,0 kb bằng với kích thước gen rapG, khuẩn lạc số 04 cho một vệt băng mờ có kích thước 3.0 kb. Do đó, khuẩn lạc số 01 được chọn để kiểm tra trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.5. (A) Ảnh chụp khuẩn lạc trắng mang vector pSET152/rapG và khuẩn
lạc xanh mang vector pSET 152 đóng vòng trên môi trường thạch
LB/apramycin/X-gal. (B) Sản phẩm PCR vùng liên gen của 04 khuẩn lạc trắng
Sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn XbaI của plasmid pSET152/rapG tách từ khuẩn lạc trắng 01 xuất hiện hai băng với kích thước khoảng 5,5 kb và 1,0 kb tương ứng với kích thước plasmid pSET152 đã cắt và gen rapG (Hình 3.6.). Giải trình tự đoạn liên gen trong plasmid pSET/rapG cho thấy toàn bộ gen rapG (990 nucleotide) đã được chèn vào vị trí gắn của pSET152 (Phụ lục 1). So sánh trình tự rapG trong plasmid pSET/rapG với trình tự gen rapG đã công bố trên GenBank cho độ tương đồng là 100%. Từ đó, chúng tôi kết luận rằng vector gây đột biến pSET152/rapG đã được tạo thành công.
Hình 3.6. Sản phẩm cắt plasmid pSET152/rapG 3.2. Tạo chủng Streptomyces rapamycinicus chuyển gen
3.2.1. Sàng lọc chủng xạ khuẩn chuyển gen trên môi trường chọn lọc
Sau 5 ngày nuôi các đĩa petri mang thể đột biến, chúng tôi thấy xuất hiện các khuẩn lạc xạ khuẩn màu trắng trên bề mặt môi trường MS có bổ sung kháng sinh, các khuẩn lạc xạ khuẩn mọc được trên môi trường này gọi là khuẩn lạc dương tính (Hình 3.7). Quá trình chuyển gen rapG vào genome chủng xạ khuẩn hoang dại dựa vào vector đột biến pSET152/rapG có nguồn gốc từ plasmid pSET 152. Plasmid pSET152 mang vị trí attP là vị trí đích của gen tích hợp φC31, đồng thời trên genome của chủng xạ khuẩn có vị trí attB có vai trò tương tự attP, do đó φC31 là gen trung gian cho quá trình tái tổ hợp gen [28]. Trong quá trình tiếp hợp, vector gây đột biến tiếp xúc với genome chủng xạ khuẩn làm vị trí của attP và attB tiếp xúc và trao đổi chéo nhau làm tích hợp toàn bộ vector pSET152/rapG (bao gồm gen kháng kháng sinh apramycin) vào genome chủng xạ khuẩn. Do đó, các khuẩn lạc xạ khuẩn chuyển gen sẽ mang gen kháng kháng sinh apramycin và có thể mọc được trên môi trường bổ sung kháng sinh apramycin.
Hình 3.7. Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn chuyển gen trên môi trường có kháng sinh
Các chủng xạ khuẩn dương tính ký hiệu I1, I7 và I18 được lựa chọn để kiểm tra bằng Southern Blot. Tế bào được thu sau khi nuôi cấy trong môi trường ISP2 dịch thể được sử dụng để tách ADN.
3.2.2. Kiểm tra chủng xạ khuẩn chuyển gen bằng phương pháp lai Southern Blot
Mẫu ADN sau khi xử lý với ARNase qua đêm cho thấy chất lượng tốt trên bản gel sau điện di (Hình 3.8). Chất lượng ADN chuẩn bị cho thí nghiệm lai Southern Blot được đánh giá bằng Nanodrop và giá trị A230/A260 thu được là 1,8 – 2,0, nồng độ ADN của các mẫu I1, I7, I18 lần lượt là 65; 36,6 và 343 ng/µL. Mẫu ADN tổng số của các chủng xạ khuẩn hoang dại và đột biến được cắt bằng cặp enzyme giới hạn BamHI và KpnI.
Kết quả lai Southern blot với đầu dò là sản phẩm PCR của gen rapG cho thấy trong điện di đồ ứng với chủng xạ khuẩn hoang dại có một băng kích thước khoảng 5,5 kb lai được với đầu dò, trong khi điện di đồ ứng với chủng xạ khuẩn chuyển gen I18 có hai băng kích thước khoảng 5,5 kb (giống chủng dại) và 4,0 kb lai được với đầu dò (Hình 3.9). Điện di đồ ứng với các chủng xạ khuẩn I1 và I7 không xuất hiện băng sáng nào, có thể do lượng ADN tổng số không đủ để phản ứng lai thành công hoặc để quan sát được kết quả lai, hay do lỗi kỹ thuật trong quá trình lai. Tuy nhiên, vì mục đích cuối cùng của chúng tôi là tìm được một chủng xạ khuẩn chuyển gen mang thêm gen rapG và kết quả cho thấy chủng I18 đã đáp ứng yêu cầu này nên
chúng tôi không làm tiếp các thí nghiệm với I1 và I7. Chủng xạ khuẩn chuyển gen I18 được đặt tên là chủng S. rapamycinicus WT/rapG.
Hình 3.9. Kết quả lai Southern blot của các chủng xạ khuẩn chuyển gen (I1, I7, I18)và chủng hoang dại (WT)
3.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh rapamycin
Đường chuẩn rapamycin được xây dựng để định lượng nồng độ rapamycin môi trường nuôi cấy và tách chiết. Các giá trị area (diện tích đỉnh hấp thụ) tại bước sóng 272 nm được thể hiện trong bảng 3.1. Phương trình đường chuẩn rapamycin như sau: y = 0,0241x – 0,5182, trong đó: x là giá trị area, y là giá trị rapamycin tương ứng với x (mg/L).
Bảng 3.1. Các giá trị dựng đường chuẩn rapamycin STT Lượng rapamycin (mg/L) Area
1 61,29 2537,3
2 30,40 1298,8
3 15,20 727,2
4 10,13 388,1
5 3,04 127,8
Hình 3.10. Đường chuẩn rapamycin
Các mẫu dịch sau tách chiết được thử hoạt tính kháng nấm C. albicans đều cho vòng hoạt tính kháng lớn, các mẫu có đường kính kháng khuẩn lên tới 25 mm (Hình 3.11.). Tuy nhiên, khi chạy phân tích mẫu bằng HPLC, lượng rapamycin thu được ở các mẫu này có sự khác nhau rõ rệt. Do đó, định lượng rapamycin bằng phân tích HPLC là cần thiết bên cạnh phương pháp đo đường kính kháng C. albicans ban đầu. Trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi sẽ định lượng và phân tích lượng rapamycin thu được bằng phân tích HPLC.
Hình 3.11. Vòng kháng nấm C. albicans của các chủng xạ khuẩn WT và WT/rapG trong các môi trường nuôi cấy khác nhau
Để xác định môi trường nuôi cấy thích hợp làm tăng khả năng sinh rapamycin của các chủng xạ khuẩn WT và WT/rapG, chúng tôi tiến hành nuôi các chủng xạ khuẩn này trong môi trường MD1, MD2 và MD3. Thành phần môi trường được thể hiện chi tiết trong phần phương pháp. Nồng độ rapamycin trong các môi trường nuôi cấy gốc của chủng WT và WT/rapG được thể hiện qua hình 3.12.
Khi nuôi hai chủng xạ khuẩn WT và WT/rapG trong môi trường MD1, lượng rapamycin thu được của chủng WT (79,2 mg/L) tương đương với lượng rapamycin của chủng WT/rapG (75,1 mg/L). Trong môi trường MD2, chủng WT/rapG cho lượng rapamycin thu được (27,4 mg/L) cao hơn gấp 5 lần so với chủng WT (5 mg/L) và trong môi trường MD3 không có sự khác biệt về lượng rapamycin thu được giữa hai chủng. Trong ba môi trường MD1, MD2 và MD3, nguồn cung cấp năng lượng ban đầu là các loại đường. Đối với môi trường MD1 sử dụng dextrin, lượng rapamycin thu được cao hơn so với MD2 và MD3 sử dụng glucose. Dextrin đã được chứng minh là yếu tố tích cực tới khả năng sinh rapamycin tốt hơn so với glucose [26]. Hàm lượng glucose trong môi trường MD2 (20 g/L) cao hơn MD3 (6 g/L) và lượng rapamycin thu được trong môi trường MD2 cao hơn MD3. Kết quả này chứng tỏ rằng các nguồn cung cấp năng lượng khác nhau có ảnh hưởng tới lượng sản phẩm rapamycin thu được. Do đó, giả thuyết chúng tôi đặt ra là quá trình sinh tổng hợp rapamycin gồm hai giai đoạn: giai đoạn đầu, tế bào xạ khuẩn cần nguồn năng lượng để tổng hợp các chất sơ cấp, chất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển; giai đoạn hai là giai đoạn sinh tổng hợp rapamycin, các yếu tố ảnh hưởng đến lượng rapamycin có thể ảnh hưởng tới giai đoạn một hoặc hai.
3.3.1. Ảnh hưởng của axit shikimic đến khả năng sinh rapamycin
Trong thí nghiệm này, chúng tôi bổ sung thêm 10 g/L bột hồi tương đương với 0,8 g/L axit shikimic vào môi trường nuôi cấy MD1, MD2, MD3. Lượng rapamycin thu được trong các môi trường này được thể hiện qua hình 3.13.
Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường bổ sung acid shikimic
Kết quả cho thấy axit shikimic có ảnh hưởng tích cực tới quá trình sinh tổng hợp rapamycin, cụ thể là lượng rapamycin thu được từ các chủng xạ khuẩn nuôi trong môi trường bổ sung axit shikimic cao hơn so với các môi trường không bổ sung. Khi bổ sung axit shikimic vào môi trường gốc MD1, lượng rapamycin thu được từ chủng WT/rapG (148,4 mg/L) tăng hơn hai lần so với nuôi trong môi trường không bổ sung (75,1 mg/L), trong khi đó chủng WT cho lượng rapamycin thu được (82,1 mg/L) tương đương với môi trường gốc (72,9 mg/L) và không có sự chênh lệch lớn. Trong môi trường MD2 bổ sung axit shikimic, lượng rapamycin thu được từ chủng WT là 35,1 mg/L và WT/rapG là 89,1 mg/L cao hơn so với trong môi trường MD2 từ 1-2 lần. Trong môi trường MD3 thêm axit shikimic, lượng rapamycin tăng nhẹ (WT – 7,6 mg/L và WT/rapG – 8,1 mg/L), không cao hơn nhiều so với môi trường MD3. Lượng rapamycin thu được từ chủng xạ khuẩn WT/rapG trong môi trường MD1 cao hơn so với lượng rapamycin thu được trong nghiên cứu của Fang A.và cộng sự (87 g/L) [14]. Fang bổ sung thêm 9,9 g/L acid shikimic vào môi trường nuôi là điều kiện tối ưu nhất để thu được lượng rapamycin lớn nhất từ chủng xạ khuẩn đột biến ngẫu nhiên S. hygroscopicus C9 [14]. Trong kết quả thí nghiệm của chúng tôi, khi bổ sung
0,8 g/L axit shikimic vào môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn chuyển gen WT/rapG cho lượng rapamycin thu được là 148,4 mg/L, cao hơn hẳn so với thí nghiệm của Fang [14].
Từ các bài báo trước đây, axit shikimic đã được chứng minh là yếu tố tham gia vào quá trình tạo tiền chất rapamycin [42]. Do đó, bổ sung dịch chiết của bột đại hồi chứa axit shikimic vào môi trường giúp tăng cường khả năng tổng hợp rapamycin của hai chủng WT và WT/rapG so với môi trường gốc. Chủng xạ khuẩn WT/rapG là chủng được tăng cường biểu hiện gen điều hòa dương rapG nên quá trình tổng hợp rapamycin của chủng WT/rapG mạnh hơn chủng WT, do đó lượng rapamycin thu được từ chủng WT/rapG cao hơn so với WT.
3.3.2. Ảnh hưởng của glycerol đến khả năng sinh rapamycin
Để đánh giá ảnh hưởng của glycerol tới khả năng sinh rapamycin của các chủng xạ khuẩn, 15 g/L glycerol được bổ sung vào các môi trường gốc MD1, MD2, MD3. Kết quả (Hình 3.12) cho thấy: trong cả ba môi trường bổ sung glycerol, chủng WT/rapG cho lượng rapamycin cao hơn so với chủng WT. Trong môi trường MD1 thêm glycerol 15g/L, chủng WT/rapG cho lượng rapamycin thu được là cao nhất (211,36 mg/L), gấp 6.5 lần chủng WT (32,7 mg/L). Trong môi trường MD2 thêm glycerol, lượng rapamycin từ chủng xạ khuẩn WT/rapG là 11,29 mg/L cao hơn gấp 5 lần chủng WT (2,2 mg/L). Đối với môi trường MD3 thêm glycerol, lượng rapamycin từ chủng xạ khuẩn WT/rapG là 44,9 mg/L cao hơn 1,3 lần so với chủng WT (34,1 mg/L). Trong nghiên cứu của Kim và cộng sự (2014), khi bổ sung 36,2 g/L glycerol vào môi trường lên men chủng xạ khuẩn đột biến bằng UV thu được lượng rapamycin là lớn nhất (130,4 mg/L) [25]. Do đó, chúng tôi cho rằng glycerol có tác động tích cực đến các chủng xạ khuẩn trong môi trường MD3, làm lượng rapamycin tăng hơn 6 lần so với môi trường không bổ sung. Tuy nhiên, glycerol tác động tiêu cực trong môi trường MD2 khi làm lượng rapamycin thu được thấp hơn so với môi trường gốc. Trong môi trường MD1 bổ sung glycerol, lượng rapamycin từ chủng xạ khuẩn WT/rapG cao hơn gấp 2,8 lần trong môi trường gốc, đối với chủng WT lượng
rapamycin giảm so với môi trường gốc. Ảnh hưởng khác nhau của glycerol có thể do sự kết hợp của glycerol với các nguồn cacbon khác nhau trong môi trường như glucose, dextrin. Các nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra rằng sự kết hợp của các nguồn Cacbon khác nhau như glucose/glycerol, fructose/ mannose ảnh hưởng tới lượng rapamycin thu được [7][26].
Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường bổ sung Glycerol
Glycerol là nguồn cung cấp nguyên liệu cho quá trình lên men và đã được chứng minh là có ảnh hưởng tích cực tới lượng rapamycin thu được [25]. Chúng tôi cho rằng glycerol được coi là chất xúc tác ở giai đoạn đầu, có vai trò cung cấp đầy đủ năng lượng cho các quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp các chất sơ cấp, tạo tiền chất rapamycin. Trong giai đoạn hai, ảnh hưởng của glycerol được thể hiện ít hơn và gen rapG đóng vai trò hỗ trợ xúc tác quá trình sinh rapamycin là chủ yếu. Trong
nghiên cứu của Kuscer E. (2007), chủng xạ khuẩn được tăng cường biểu hiện gen
rapG cho lượng rapamycin cao hơn gấp 1,2 lần so với chủng hoang dại và khi xóa
gen rapG lượng rapamycin thu được giảm tới 6 lần so với chủng hoang dại [29]. Thí nghiệm này cho thấy gen rapG có vai trò tích cực trong quá trình sinh tổng hợp
nên quá trình chuyển hóa ở giai đoạn hai sẽ được đẩy mạnh hơn so với chủng WT, lượng rapamycin thu được từ chủng WT/rapG sẽ cao hơn so với chủng WT. Lượng rapamycin thu được từ chủng WT/rapG trong môi trường MD1 bổ sung glycerol thu