2.2.5.1. Phương pháp sàng lọc trên môi trường thạch
Sau 5-8 ngày, các khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn chuyển gen nhờ vector pSET152/rapG được cấy chuyển sang đĩa môi trường MS bổ sung apramycin 10 mg/L, nhằm mục đích sàng lọc một lần nữa để loại bỏ các chủng xạ khuẩn không mọc được trên môi trường này. Chọn chủng xạ khuẩn có khả năng mọc trên môi trường MS có kháng sinh và nuôi trong môi trường YS lỏng, thu sinh khối. Tách ADN tổng số chủng xạ khuẩn chuyển gen và chuẩn bị cho thí nghiệm tiếp theo.
2.2.5.2. Phương pháp lai Southern blot
Phương pháp lai Southern blot dùng để xác định vị trí một gen cụ thể trong hệ gen. Trong nghiên cứu này, sử dụng lai Southern blot để xác định số lượng bản sao của gen rapG trong chủng xạ khuẩn theo quy trình như sau:
1. Tách ADN tổng số của các chủng xạ khuẩn bằng kit và xử lý với RNase để loại bỏ hết ARN.
2. Cắt ADN tổng số với enzyme giới hạn BamHI và KpnI: 25 µL ADN, 2 µL enzyme giới hạn mỗi loại, 4 µL Buffer, 7 µL dH2O, 37°C, qua đêm.
3. Tra mẫu ADN sau cắt lên gel agarose và soi dưới đèn UV. Dùng một bản giấy parafin đặt lên bản gel, đánh dấu vị trí các giếng, các băng sáng, thang marker.
4. Xử lý bản gel với dung dịch HCl 0.25M, 10 phút đến khi thuốc nhuộm (dye) chuyển màu nhằm khử purine và cắt ADN thành các mảnh nhỏ hơn.
5. Biến tính ADN, tách sợi đôi thành sợi đơn: ngâm bản gel trong dung dịch NaOH 0.5M, NaCl 1.5M, 30 phút, nhiệt độ phòng đến khi thuốc nhuộm (dye) chuyển về màu xanh.
6. Chuyển ADN đã biến tính lên màng: Đặt giấy lọc Whatman 3MM phủ lên bệ đỡ sao cho hai bên tờ giấy nhúng chìm trong đệm chuyển (SSC 10X). Làm ướt giấy lọc bằng buffer SSC 10X và đặt 2 tờ giấy lọc lên chính giữa bệ đỡ. Đặt bản gel lên trên giấy lọc, đặt màng nylon lên trên gel, thấm ướt màng nylon bằng dung dịch đệm. Đặt thêm 2 tờ giấy lọc lên phía trên màng, xếp tiếp 3 lớp khăn giấy lên trên. Dùng một miếng kính nhỏ phủ toàn bộ phía trên gel và đặt một vật tương đối nặng lên phía trên cùng (đặt vật quá nặng sẽ làm nát bản gel bên dưới). Quá trình chuyển ADN lên màng dựa trên nguyên lý mao dẫn: lực mao dẫn kéo dung dịch đệm lên, đi qua gel và di chuyển tới màng, ADN sợi đơn sẽ gắn với màng. Sau 3 giờ, bỏ các lớp giấy lọc, giấy thấm, rửa màng nylon với dung dịch đệm SSC 6X. Xử lý màng bằng tia UV, hình thành liên kết với màng.
Hình 2.4. Chuyển ADN biến tính lên màng
7. Ủ màng trong dung dịch đệm tiền lai (SSC 6X, SDS 0,5%, ADN biến tính (sợi đơn), formamide 50%) 42°C, 2-4 giờ. Vai trò của bước tiền lai là khóa các vị trí không đặc hiệu, ngăn mẫu dò sợi đơn gắn với bất kỳ vị trí nào trên màng. Sau đó, bổ sung đệm và probe mang trình tự gen rapG có gắn phóng xạ P32, ủ 42°C, qua đêm để liên kết bổ sung giữa các sợi ADN hình thành. Probe sẽ liên kết với trình tự tương ứng trên màng lai. Vì probe được thiết kế chứa trình tự gen rapG nên chỉ có thể bắt cặp được với sợi đơn ADN trên màng lai.
8. Rửa màng ít nhất 3 lần bằng dung dịch SSC 2X, SDS 0,1%, 52°C, 30 phút để loại bỏ các mẫu dò không tạo liên kết.
9. Đưa màng lên phim và chiếu qua tia X, đọc kết quả.