Đoạn gen rapG được khuếch đại bằng phương pháp PCR từ ADN của chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus DSM41530 và cặp mồi cho gen rapG (Bảng 2.2). Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt: 95°C- 5 phút; (95°- 30 giây, 62°C- 15 giây, 72°C- 1 phút 30 giây) × 30 chu kỳ; 72°C- 7 phút. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên agarose 1% với hiệu điện thế 100V trong 20 phút. Kích thước rapG trên bản gel được kiểm tra dựa vào thang chuẩn ADN.
Sản phẩm PCR của gen rapG được tinh sạch bằng kit AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc). Nồng độ và chất lượng ADN được kiểm tra bằng nanodrop trước khi thực hiện phản ứng cắt với enzyme giới hạn XbaI. Hỗn hợp cắt gồm 17 µL sản phẩm PCR của rapG sau tinh sạch, 2 µL Buffer, 1µL XbaI được ủ ở 37°C trong 2 giờ. Trong một phản ứng độc lập, plasmid pSET152 sau khi được kiểm tra chất lượng và nồng độ được cắt với XbaI. Sản phẩm cắt được kiểm tra bằng điện di trên agarose 1%. Sản phẩm cắt đúng kích thước được tinh sạch sử dụng kit AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc).
Phản ứng nối được thực hiện gồm: 7 µL H2O, 2 µL plasmid pSET152 đã cắt, 10 µL rapG đã cắt, T4 Buffer 2 µL, T4 Ligase 1 µL, hỗn hợp ủ ở 22°C qua đêm. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và trải trên môi trường LB bổ sung kháng sinh apramycin 50 mg/L, IPTG 1M, X-gal 20mg/L. Những khuẩn lạc của tế bào mang plasmid pSET/rapG có màu trắng trên môi trường chọn lọc. Các khuẩn lạc màu trắng được kiểm tra bằng cách PCR với mồi M13F và M13R. Khuẩn lạc sau khi được kiểm tra sẽ chuyển sang nuôi trên môi trường dịch thể LB và giữ chủng ở -80°C. Đồng thời, tách plasmid từ khuẩn lạc được chọn để lưu trữ plasmid và chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp theo.