Plasmid pSET152/rapG được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng
ET12567/pUZ8002 và được sàng lọc trên môi trường LB thạch bổ sung apramycin 50 mg/L, chloramphenicol 25 mg/L, kanamycin 50 mg/L. Phương pháp tiếp hợp thực hiện giữa vi khuẩn E. coli ET12567/pUZ8002 mang vector pSET152/rapG và bào tử chủng xạ khuẩn S. rapamycinicus DSM 41530. Quy trình thực hiện như sau:
1. Xử lý tế bào vi khuẩn E. coli chủng ET12567/pUZ8002 mang vector
pSET152/rapG: Chủng vi khuẩn được nuôi lắc trong 5 mL LB dịch thể bổ sung kháng sinh apramycin 50 mg/L, chloramphenicol 25 mg/L, kanamycin 50 mg/L, 37°C, 160 rpm nuôi qua đêm. Bổ sung 500 µL dịch nuôi vào 50 mL LB mới, nuôi lắc 3-4 giờ để OD600 đạt 0,5. Ly tâm 3500 rpm, 5 phút, bỏ dịch nuôi thu sinh khối. Sau đó, rửa tế bào với dịch lỏng LB hai lần. Hòa sinh khối với 500 µL LB và giữ trên đá.
2. Xử lý bào tử xạ khuẩn: Bào tử xạ khuẩn được thu từ đĩa thạch YS nuôi sau 8 ngày và cho qua màng lọc để giảm bớt các sợi xạ khuẩn, giữ bào tử xạ khuẩn với dung dịch glycerol 15%. Ly tâm ống giữ bào tử 8000 rpm, 5 phút, bỏ phần dịch glycerol. Bổ sung 500 µL môi trường 2YT, vortex. Ủ ống ở 45°C trong 15 phút, sau đó chuyển ngay các ống bào tử vào khay đá lạnh.
3. Trộn 500 µL chủng E. coli ET12567/pUZ8002 mang pSET152/rapG đã
được xử lý với 500 µL bào tử xạ khuẩn đã xử lý, để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Ly tâm 5000 rpm, 5 phút, bỏ bớt dịch nổi. Trải hỗn hợp tế bào trên đĩa môi trường MS có bổ sung MgCl2 10mM. Sau 14-16 giờ nuôi đĩa MS tại 30°C, bổ sung 1 mL hỗn hợp kháng sinh apramycin có nồng độ 10 mg/L và nalidixic acid 50 mg/L lên các đĩa. Các đĩa biến nạp được nuôi ở 28°C trong 5-8 ngày.