2.2.6.1. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Rapamycin trong các mẫu được định tính bằng phương pháp thử hoạt tính kháng nấm Candida albicans VTCC 40674 trên đĩa thạch. Chủng C. albicans VTCC 40674 được nuôi trong môi trường YM dịch thể ở 30°C, tốc độ lắc 160 rpm qua đêm. Môi trường thạch YM khoảng 45°C được bổ sung dịch nuôi C. albicans để đạt được OD600 = 0,01. 25 mL thạch lỏng chứa C. albicans được đổ vào đĩa peptri, làm nguội ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các giếng với đường kính 5 mm được đục trên bề mặt đĩa thạch. Nhỏ 40 µL mẫu - dịch sau tách chiết đã pha loãng 10 lần vào giếng, ủ đĩa ở
30°C, qua đêm. Lượng rapamycin được thể hiện bằng đường kính vòng vô khuẩn trên đĩa C. albicans.
2.2.6.2. Phương pháp tách chiết rapamycin
Rapamycin được tách từ sinh khối của chủng xạ khuẩn: Xạ khuẩn nuôi trên đĩa thạch môi trường YS trong 96 giờ, 30°C. 10 thỏi thạch với đường kính 5 mm chứa hệ sợi xạ khuẩn được nuôi cấy trong môi trường dịch thể sinh rapamycin, tốc độ lắc 200 rpm, 28°C trong 72 giờ. Ly tâm tốc độ 4000 rpm trong 20 phút để thu toàn bộ sinh khối, bổ sung 7.5 ml methanol vào sinh khối, vortex để sinh khối trộn đều trong dung môi. Lắc hỗn hợp ở 160 rpm qua đêm ở nhiệt độ phòng. Ly tâm tốc độ 4000 rpm trong 20 phút và thu dịch trong. Dịch sau tách được hòa tan trong dịch nuôi cấy tế bào. Sau đó, bổ sung ethylacetate với tỉ lệ thể tích 1:1, lắc hỗn hợp ở 160 rpm, 30°C trong 2 giờ. Ly tâm thu phân lớp trên của ethylacetate. Dung môi chứa rapamycin sau khi tách được cô quay đến khô và hòa tan bằng methanol. Mẫu được giữ ở -20°C.
2.2.6.3. Phương pháp định lượng rapamycin
Dịch chứa rapamycin sau khi tách được phân tích và thu hồi bằng hệ thống HPLC sử dụng cột Eclipse XDB- C18 (4,6×150 mm, 5 µm), hai pha dung môi của hệ thống gồm pha A là nước miliQ và pha B là dung môi acetonitrile 100%, tỉ lệ dung môi và nước bơm qua cột Eclipse XDB- C18 được thể hiện trong bảng 2.3. Quá trình phân tách chất trong 35 phút, tốc độ dòng 1,2 mL/phút, lượng mẫu phân tích là 40 µL. Rapamycin được phát hiện tại bước sóng hấp phụ là 272 nm.
Để đánh giá nồng độ rapamycin trong mẫu thử nghiệm, rapamycin được thu hồi sau khi phân tách bằng hệ thống HPLC. Sau khi đông khô rapamycin thu được, độ tinh sạch của rapamycin được đánh giá bằng HPLC. Lượng rapamycin tinh sạch được sử dụng để xây dựng đường chuẩn làm cơ sở đánh giá nồng độ rapamycin của các mẫu thử nghiệm.
Bảng 2. 3. Tỉ lệ hai pha dung môi qua cột HPLC Thời gian
( phút )
Dung môi
A-H2O (%) B – acetonitrile (%)
3.00 85 15
25.00 15 85
29.00 15 85
32.00 85 15
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN