2.2.2.1. Tách chiết plasmid
Plasmid được tách từ tế bào vi khuẩn bằng bộ kit DNA-spin™ Plasmid DNA Purification Kit (Intron) theo các bước sau:
1. Tế bào vi khuẩn mang plasmid được nuôi trong 5 mL môi trường LB dịch thể có bổ sung kháng sinh Apramycin 50 mg/L, nuôi lắc 160 rpm, qua đêm, 37°C. Ly tâm với vận tốc 8000 rpm, 5 phút, nhiệt độ phòng, bỏ dịch và thu phần sinh khối tế bào.
2. Bổ sung 250 µL dung dịch đệm 1 (Resuspension Buffer) đã thêm RNase vào sinh khối, vortex để tế bào hòa lẫn vào dung dịch đệm. Thêm 250 µL dung dịch 2 (Lysis Buffer) vào hỗn hợp trên, đảo nhẹ ống và ủ trong 3 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm 350 µL dung dịch 3 (Neutralization Buffer), đảo ống nhẹ nhàng và ủ trên đá 5 phút.
4. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 rpm, 10 phút, 4°C để các mảnh vỡ tế bào và protein biến tính lắng xuống đáy ống. Dịch nổi sau ly tâm được đưa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 13000 rpm, 1 phút. Plasmid được giữ trên lớp màng của cột tinh sạch, bỏ phần dịch qua cột.
5. Rửa plasmid với 500 µL đệm rửa (Washing Buffer A) và ly tâm 13000 rpm trong 1 phút, bỏ phần dịch qua cột. Tiếp tục rửa plasmid với 700 µL đệm rửa (Washing Buffer B), 13000 rpm trong 1 phút, bỏ phần dịch qua cột. Có thể lặp lại thêm một lần bước rửa plamid với Washing Buffer B để tăng độ sạch của mẫu. Ly tâm cột 13000 rpm trong 1 phút để làm khô màng cột.
6. Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 mL mới. Bổ sung 50-100 µL dH2O vào chính giữa màng cột, ủ cột trong bể ổn nhiệt 65°C trong 10 phút, ly tâm 10000 rpm, 1 phút. Mẫu plasmid tinh sạch được bảo quản ở -20°C.
2.2.2.2. Tách chiết ADN tổng số
Chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus DSM 41530 và các chủng xạ khuẩn khác được nuôi trong môi trường ISP2 dịch thể để thu tế bào và tách ADN tổng số bằng bộ kit E.N.Z.A Bacterial DNA kit (Omega) theo các bước sau:
1. Chủng xạ khuẩn được nuôi trong môi trường dịch thể ISP2, 3 ngày, 160 rpm, 30°C để tăng lượng sinh khối. Thu 3-5 mL dịch nuôi, ly tâm 8000 rpm, 5 phút để thu sinh khối.
2. Thêm 100 µL đệm TE, vortex đến khi hòa đều sinh khối vào dung dịch đệm. Bổ sung 10 µL Lysozyme 50 mg/mL và ủ trong bể ổn nhiệt 37°C, 2 giờ.
3. Thêm 100 µL dung dịch đệm TL và 20 µL Protein K, vortex mạnh, ủ 55°C trong bể ổn nhiệt, 1 giờ, 20-30 phút đảo ống một lần. Thêm 5 µL RNase, đảo ống 10 lần và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm hỗn hợp trên 10000 rpm, 2 phút để các mảnh tế bào lắng xuống đáy ống.
4. Chuyển toàn bộ phần nổi sang ống Eppendorf 1,5 mL mới, thêm 220 µL dung dịch đệm BL, vortex mạnh và ủ trong 65°C, 10 phút. Sau đó, bổ sung 220 µL ethanol 96%, vortex 20 giây.
5. Chuyển toàn bộ hỗn hợp lên cột, ly tâm 10000 rpm, 1 phút, bỏ phần dịch qua cột. Thêm 500 µL dung dịch HBC và ly tâm 10000 rpm trong 1 phút, bỏ dịch qua cột. Rửa cột với 700 µL DNA Wash Buffer, ly tâm 10000 rpm trong 1 phút, bỏ dịch. Có thể lặp lại thêm một lần bước rửa cột với DNA Wash Buffer. Ly tâm cột 13000 rpm, 2 phút để làm khô cột.
6. Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 mL mới, bổ sung 50-100 µL dH2O vào chính giữa màng cột, ủ cột trong bể ổn nhiệt 65°C, 10 phút. Ly tâm 10000 rpm, 1 phút. Mẫu ADN tổng số được bảo quản ở -20°C.
2.2.3. Phương pháp biến nạp
Phương pháp biến nạp được thực hiện để chuyển plasmid vào tế bào khả biến – là những tế bào có khả năng nhận ADN lạ từ ngoài vào trong tế bào. Trong nghiên cứu này, các sản phẩm nối được biến nạp vào các tế bào khả biến E. coli DH5α, vector gây đột biến biến nạp vào tế bào khả biến E. coli ET12567/pUZ8002.
Tạo tế bào khả biến: Chủng E. coli DH5α được nuôi trong môi trường dịch
thể LB. Chủng E. coli ET12567/pUZ8002 được nuôi trong 5 mL dịch thể LB có bổ sung chloramphenicol 25 mg/L, kanamycin 50mg/L, nuôi lắc 120 rpm qua đêm ở 37°C. Sau đó, 500 µL dịch nuôi được chuyển sang nuôi cấy trong 50 mL môi trường
LB, ở 37°C, 120 rpm đến khi đạt OD600 khoảng 0,3–0,4. Dịch nuôi được giữ ở 4°C trong 5 phút và chuyển sang ống falcon 50 mL. Tế bào được thu bằng cách ly tâm với tốc độ 5000 rpm trong 10 phút ở 4°C và bỏ dịch sau ly tâm. Bổ sung 50 mL dung dịch CaCl2 0,05 M (đã giữ ở 4°C), trộn đều bằng pipet và ủ mẫu ở 4°C trong 30 phút. Dịch được loại bỏ bằng ly tâm với tốc độ 5000 rpm trong 10 phút, 4°C. Thêm 10 mL hỗn hợp CaCl2 (lạnh) 0.05 M pha trong glycerol 15%, trộn đều bằng pipet. Lấy 200 µL hỗn hợp cho vào ống eppendorf và làm lạnh nhanh trong nito lỏng. Bảo quản các ống trong tủ lạnh sâu (- 80°C).
Phương pháp biến nạp: Plasmid tách bằng kit được trộn đều với 100 µL tế
bào khả biến bằng pipet và giữ trong đá lạnh 20 phút. Sau đó, cho hỗn hợp tế bào và plasmid vào bể ổn nhiệt ở 42°C trong 45 giây. Lấy ống phản ứng cho vào đá lạnh 3 phút. Tế bào sau khi sốc nhiệt được nuôi trong 1 mL môi trường LB dịch thể, nuôi lắc 160 rpm trong 2 giờ ở 30°C. Trải dịch lên đĩa thạch LB có bổ sung kháng sinh hoặc chất chỉ thị chọn lọc thích hợp. Đĩa pepetri được ủ ở 37°C trong 24 giờ. Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.