4. Chuyển gen ở thực vật
4.2.1. Các hệ thống vector sử dụng trong chuyển gen thực vật
Để có thể chuyển gen vào thực vật thông qua A.tumefaciens người ta phải sử dụng một hệ thống vector chuyển gen. Có hai loại vector chuyển gen đó là vector liên hợp và vector nhị thể.
4.2.1.1. Vector liên hợp (cointegrate)
Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn. Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T-DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên kết. Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng T-DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh). Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững của plasmid trong A. tumefaciens.
Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những phần sau: Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli. Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens. Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật. Đoạn khởi đầu của E. coli, không hoạt động ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi vào trong tế bào thực vật (Lê Trần Bình ; Phan Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003).
4.2.1.2. Vector nhị thể (binary vector)
Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T-DNA.
Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A.tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các phần như sau: Vị trí ghép nối đa điểm, đoạn khởi đầu tái bản hoạt
động cả ở E. coli và A.tumefaciens, gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật, gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A.tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp, đoạn T-DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T-DNA (Lê Trần Bình ; Phan Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003, Hanif M. 2004).
Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T-DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật (Lê Trần Bình ; Phan Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003).
Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium vào nhiều loài thực vật khác nhau (Lê Trần Bình ; Phan Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003, Michielse B. C ; Hooykaas P. J. J. 2008).
4.2.1.3. Giới thiệu về vector pCambia 1301
Các vector chỉ thực hiện được chức năng của mình khi chúng có một số đặc tính như: có khả năng tự sao chép độc lập và tích cực trong tế bào vật chủ; có kích thước nhỏ, dễ nhận gen quan tâm, dễ xâm nhập và được sao chép; mang một số dấu hiệu chọn lọc giúp phân biệt các tế bào mang plasmid tái tổ hợp với các tế bào không có plasmid tái tổ hợp, tồn tại bền vững trong tế bào vật chủ. Các đặc tính này là cơ sở quyết định các thành phần chính của plasmid với: Gen quan tâm được gắn thêm đoạn khởi động và đoạn kết thúc; gen chỉ thị chọn lọc; các thành phần khác như vùng khởi đầu sao chép và vùng trình tự nhân dòng đa điểm cắt (MCS) (Lê Thanh Hòa 2003). Vector pCambia 1301 có kích thước khoảng 11,8 Kb có chứa promoter CaMV 35S là một promoter mạnh dùng để biểu hiện trong tế bào thực vật với các thành phần chính như sau:
Đoạn khởi động gen (promoter)
Promoter 35S là một dạng chuỗi khởi động xây dựng được tách từ virus khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic virus 35S promoter CaMV35S-P), loại promoter nos
(Lê Thị Thu Hiền 2003). Trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật, CaMV35S-P được sử dụng rộng rãi nhờ khả năng hoạt động mạnh ở nhiều loại mô của cây hai lá mầm, tuy nhiên nó lại ít hoạt động ở cây một là mầm. Để khắc phục nhược điểm này, CaMV35S-P được sử dụng kết hợp với các thành phần khởi động khác, chẳng hạn vector pEmu chứa nhiều bản sao của các tiểu phần phản ứng kị khí của gen Adh1 từ ngô và các tiểu phần của gen tổng hợp octopin từA. tumefaciens đã làm gia tăng sự biểu hiện của gen trong cây một là mầm lên hàng chục lần (Nguyễn Đức Thành 2003).
Promoter 35S dài 350bp, gồm 3 thành phần: Hộp TATA ( ở vị trí từ - 46 đến + 8), vùng tăng cường A (enhancer) từ vị trí -90 đến -46, làm tăng biểu hiện gen ngoại lai ở rễ, vùng tăng cường B (enhancer) từ vị trí -343 đến -90, làm tăng biểu hiện gen chuyển ở lá. Trong vùng B gồm 5 phần nhỏ từ B1- B5 phân chia theo mức độ phản ứng của mỗi vùng đối với các yếu tố dịch mã khác nhau (Chilton M.D. 1993).
Nếu xảy ra sự thay đổi trong vùng tăng cường từ vị trí -207 đến -56 có thể dẫn đến mất khả năng gây nhiễm của virus. Lợi dụng tính chất này, có thể gắn gen ngoại lại vào vùng enhancer sẽ làm mất khả năng gây nhiễm của virus khảm súp lơ (Chilton M.D. 1993).
Đoạn kết thúc
Các đoạn kết thúc thường chứa đuôi polyA như AATTAA, hoặc AACCAA giúp bảo vệ các phân tử ARN thông tin được bền vững hơn và tránh được sự phân huỷ. Hai đoạn kết thúc được sử dụng nhiều trong công nghệ gen thực vật là đoạn kết thúc của CaMV35S (có mặt trong 7 sản phẩm chuyển gen hiện nay) và đoạn kết thúc NOS có mặt trong ít nhất 16 - 28 sản phẩm (Lê Thị Thu Hiền 2003).
Gen chỉ thị
Các chỉ thị chọn lọc di truyền sử dụng trong biến nạp thực vật thường có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc thực vật, gồm 2 loại chính:
Chỉ thị chọn lọc (selectable marker): Kết cấu gen mang đoạn khởi động NOS(nopaline synthase promoter-terminater) điều khiển sự biểu hiện gen kháng npt2 (neomycin phospho transferase gene), chỉ có những thể biến nạp sống được trên môi trường có kháng sinh kanamycin (Lê Thanh Hòa 2003).
Chỉ thị sàng lọc (screenable marker): Gen chỉ thị sàng lọc cần có một số đặc điểm sau: sản phẩm của nó là độc nhất và không độc đối với tế bào thực vật, các enzym chỉ thị phải có khả năng dịch mã ổn định cao, phương pháp phân tích thuận tiện, rẻ tiền, độ nhạy cao và có khả năng phản ứng với các polypeptit ngoài mà không ảnh hưởng hoạt tính enzym (Lê Thị Thu Hiền 2003).
Vùng khởi động sao chép và MCS
Vùng pUC ori: vùng khởi động sao chép trong E. coli, có nguồn gốc từ vectorpUC9.
RK 2 ori V: vùng khởi động sao chép trong A. tumefaciens, có nguồn gốc từ plasmid RK2.
Vùng MCS có chứa trình tự điểm cắt của rất nhiều loại enzym. Trong đó chúng ta quan tâm đến hai loại enzym là Eco72I và NcoI, trình tự điểm cắt của chúng ở hai đầu của gen GUS. Vì vậy khi cắt pCambia 1301 bằng hai loại enzym trên sau đó điện di chúng ta sẽ thu được hai băng tương ứng với kích thước khoảng 9,8 Kb (vector) và 2 Kb (gen GUS). Nếu gắn vào đoạn gen ngoại lai mà ta mong muốn thì gen GUS không được biểu hiện. Điều này rất có ý nghĩa trong việc chọn lọc thể biến nạp (Lê Thanh Hòa 2003).
Trong tương lai, việc tối ưu hoá hệ thống vector và cải tiến các vector trên cơ sở nghiên cứu tỉ mỉ các yếu tố tham gia vào quá trình chuyển nạp ổn định, các yếu tố đa gen chuyển nạp vào vị trí nhất định trong genome thực vật và các điều kiện nuôi cấy tái sinh cây chuyển gen vẫn là những vấn đề cần thiết trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật.
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu
- Tách và nhân dòng gen arsC (từ cây dương xỉ Pytirogramma calomelanos) - Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC.
- Chuyển gen arsC vào cây thuốc lá và tái sinh cây chuyển gen.
- Chứng minh sự có mặt của các gen chuyển nạp trong cây chuyển gen bằng PCR