4. Chuyển gen ở thực vật
3.1. Tách dòng gen arsC từ RNA của cây dương xỉ Pityrogramma
3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số
Lá bánh tẻ cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos lấy từ vùng mỏ than Đại Từ, Thái Nguyên được sử dụng để tách RNA tổng số. Đây là loài dương xỉ đã đươc Viện Công nghệ môi trường xác định là có khả năng hấp thụ và tích lũy Asen cao. RNA thu được lưu giữ trong nước cất khử trùng có bổ sung 0,01% DEPC. Kết quả kiểm tra RNA tổng số bằng điện di trên gen agarose được thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. RNA tổng số tách từ lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos chưa xử lý Dnase, M: Marker Fermentas 1kb và 1,2: RNA tổng số chưa xử lý Dnase
Hình 3.1 cho thấy các mẫu RNA từ lá dương xỉ có hàm lượng cao. Sau đó mẫu được xử lý Dnase cho đủ độ tinh sạch để tiến hành phản ứng RT-PCR.
3.1.2. Phản ứng RT-PCR
Phản ứng RT-PCR được tiến hành theo bộ kit tổng hợp cDNA 2 bước của Affymetrix (Mỹ). Cặp mồi khuếch đại gen được thiết kế từ trình tự gen arsC số hiệu X80057.1 trên ngân hàng gen:
Mồi xuôi arsC- NcoI/F được thiết kế với vị trí cắt của enzyme NcoI, mồi ngược arsC- Eco72I/R với vị trí cắt của enzyme Eco72I. Đây là hai enzyme chỉ có
duy nhất một vị trí cắt trên vector pCambia 1301 và không có điểm cắt nào trên đoạn gen mục tiêu để thuận tiện khi nối ghép đoạn gen arsC vào vector chuyển gen trong các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả phản ứng RT-PCR sau khi điện di kiểm tra trên gel agarose 1% được thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR, M: Marker Fermentas 1Kb, ĐC: Phản ứng RT-PCR với mẫu nước cất, 1,2: Phản ứng RT-PCR với mẫu RNA.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm trên hình 3.2 cho thấy xuất hiện đoạn gen đúng với kích thước của gen arsC theo lý thuyết (khoảng gần 500bp). Băng gọn, không có băng, vạch lạ và đủ độ tinh sạch. Như vậy, chúng tôi đã thành công trong việc tách gen arsC từ RNA tổng số của lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos.
3.1.3. Biến nạp cấu trúc gen arsC vào vector tách dòng pBT
Vector pBT là vector tách dòng TA-Cloning với 2 Thyminde ở 2 đầu thuận lợi cho việc gắn gen theo cơ chế tách dòng T-A. Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR có xu hướng gắn Adenin vào mạch mới tổng hợp và không phụ thuộc vào khuôn, do vậy sản phẩm PCR do Taq polymerase tạo ra không có đầu bằng mà có một nucleotide A nhô ra ở đầu 3’. Gen arsC sau khi PCR được gắn trực tiếp vào plasmid theo cơ chế bổ sung A ở sản phẩm PCR với T ở đầu của vector pBT, hình thành liên kết T-A. Vector có chứa gen chọn lọc kháng sinh kháng ampicilin để chọn lọc các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp đồng thời loại trừ các vi khuẩn nhiễm tạp khác.
Gen arsC sau khi được khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu arsC- NcoI/F và
arsC- Eco72I/R được gắn vào vector pBT bằng phản ứng ligate ở 22oC qua đêm, biến nạp sản phẩm vào tế bào khả biến E.coliDH5α. Tế bào vi khuẩn biến nạp được nuôi phục hồi trên môi trường LB lỏng trong vòng 2 giờ. Sau đó cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung chất kháng sinh Amp (100µg/ml) để kiểm tra các chủng biến nạp. Nuôi qua đêm ở 37oC. Chọn 10 khuẩn lạc nuôi lắc trong môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh chọn lọc Amp (100µg/ml) qua đêm. Sau đó tiến hành tách chiết plasmid kiểm tra sự có mặt của pBT, đồng thời tiếp tục nuôi lỏng các dòng vi khuẩn này. Sau khi tách chiết plasmid, xử lý plasmid với Rnase, tinh sạch rồi điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả cho các băng rõ và đúng với kích thước của plasmid pBT đã biến nạp thêm gen arsC (~3.2 kb).
Hình 3.3. Kết quả tách chiết plasmid pBT- arsC, M: Marker Fermentas 1kb, 1- 10: Plasmid tách được từ các dòng khuẩn nạp sau khi biến nạp, ĐC: Mẫu đối chứng là plasmid tách từ khuẩn lạc không biến nạp
3.1.4. Kiểm tra vector pBT-arsC
Để chắc chắn sự có mặt của gen arsC trong vector tách dòng pBT chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR và cắt bằng enzyme giới hạn.
Kiểm tra vector pBT-arsC bằng phản ứng PCR
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi arsC-NcoI/F và arsC-EcoR72I/R. Mẫu đối chứng là plasmid pBT không mang gen arsC. Kết quả phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.4).
Hình 3.4. Kết quả PCR pBT-arsC với cặp mồi đặc hiệu, M: Marker Fermentas 1kb, ĐC: Sản phẩm PCR vector pBT không mang gen arsC, 1-9: Sản phẩm PCR vector pBT- arsC
Kết quả phản ứng PCR cho các băng đúng với kích thước gen arsC theo tính toán lý thuyết (gần 500bp). Để khẳng định thêm nữa sự có mặt của gen arsC trong vector pBT chúng tôi tiến hành kiểm tra đồng thời bằng các enzyme cắt giới hạn.
Kiểm tra vector pBT-arsC bằng enzyme cắt giới hạn BamHI
Vector tách dòng pBT có chứa 2 điểm cắt của enzyme BamHI ở 2 đầu gắn gen, thuận tiện cho việc kiểm tra gen gắn. Theo tính toán lý thuyết thì sản phẩm của phản ứng cắt enzyme sẽ cho hai đoạn có kích thước đoạn 1 là gen arsC và đoạn còn lại bằng với kích thước chiều dài vector pBT. Kết quả điện di sản phẩm cắt pBT-
arsC bằng enzyme BamHI (Hình 3.5) cho thấy cả 4 plasmid đều thu được các phân đoạn có các kích thước tương ứng với dự tính, chứng tỏ đã thành công trong việc nối ghép gen arsC vào vector nhân dòng pBT .
Hình 3.5. Kết quả cắt pBT-arsC bằng BamHI, M: Marker Fermentas 1kb,1-4: Sản phẩm cắt pBT-arsC bằng BamHI.
Còn một cách kiểm tra bằng enzyme NcoI và Eco72I cũng được chúng tôi tiến hành. Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại gen arsC được thiết kế với 2 điểm cắt của 2 enzyme giới hạn NcoI và Eco72I ở 2 đầu. Do vậy dễ dàng cắt pBT-arsC bằng các enzyme giới hạn NcoI và Eco72I để kiểm tra sự có mặt của gen arsC. Kết quả phản ứng cắt cho ra 2 vạch băng tương ứng với vector pBT ( khoảng 2.7kb) và gen
arsC (khoảng gần 500bp) (Hình 3.6). Như vậy hoàn toàn có thể khẳng định vector pBT-arsC đã được thiết kế.
Hình 3.6. Kết quả cắt pBT-arsC bằng NcoI và Eco72I, M: Marker Fermentas 1kb, 1-4: Sản phẩm cắt pBT- arsC bằng NcoI và Eco72I
3.1.5. Xác định trình tự gen trình tự gen arsC
Để khẳng định chính xác đoạn DNA nhân bản và nhân dòng vào vector pBT đúng là đoạn gen mục tiêu, vector tái tổ hợp pBT-arsC được gửi đi giải trình tự tại hãng Macrogen (Hàn Quốc) bằng cặp mồi arsC- NcoI/F và arsC- Eco72I/R. Sau đây là kết quả giải trình tự chúng tôi nhận được:
GGCCGGAAGGGGTGCAGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCACTCTTTACATGGACTGATATGAGCAACATTACCATTTATCA CAACCCGGTCTGCGGCACGTCGCGTGGAGATGATCCGCAACAGCGGCACAGAACCGACTATTATCCATTATCTGGAAACT CCGCCAACGCGCGATGAACTGGTCAAACTCATTGCCGATATGGGGATTTCCGTACGCGCGCTGCTGCGTAAAAACGTCGA ACCGTATGAGGAGCTGGGCCTTGCGGAAGATAAATTTACTGACGATCGGTTAATCGACTTTATGCTTCAGCACCCGATTC TGATTAATCGCCCGATTTGGTGACGCCGCTGGGAACTCGCCTGTGCCGCCCTTCAGAAGTGGTGCTGGAAATTGCCAGAT GCGCAAAAAGGCGCATTCTCCAAGGAAGATGGCGAGAAAGTGGTTGATGAAGCGGGTAAGCGCCTGAAATAA GCTAGCTAAAGCTTGGATCCCCGGGTACCGAGCTAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC GCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACA TTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCG GGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGA GCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAA AAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCA TCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGC
CTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTC AGCCCGACCGCTGGGCCTTATCCGGGAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACCCGACTATCGCCACTGGCAGCAG CCACTGGTAACAGGATTACCAAACCGGGG
So sánh trình tự nucleotide đoạn gen thu được với trình tự gen gốc mang mã số X80057.1 trên Gene Bank bằng phần mềm DNAstar và BioEdit cho kết quả độ tương đồng về trình tự nucleotide là 99%, độ che phủ 100% (hình 3.7). Số nucleotide sai khác là 1/426 nu (nucleotide số 32 thay C bằng T). Điều này chứng tỏ đã phân lập được chính xác đoạn gen arsC mong muốn ở cây dương xỉ
Pityrogramma calomelanos.
Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident Links
59375 782 782 100% 0.0 99%
>lcl|59375 Length=426
Score = 782 bits (423), Expect = 0.0 Identities = 425/426 (99%), Gaps = 0/426 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 ATGAGCAACATTACCATTTATCACAACCCGGTCTGCGGCACGTCGCGTAATACGCTGGAG 60 ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1 ATGAGCAACATTACCATTTATCACAACCCGGCCTGCGGCACGTCGCGTAATACGCTGGAG 60 Query 61 ATGATCCGCAACAGCGGCACAGAACCGACTATTATCCATTATCTGGAAACTCCGCCAACG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 ATGATCCGCAACAGCGGCACAGAACCGACTATTATCCATTATCTGGAAACTCCGCCAACG 120 Query 121 CGCGATGAACTGGTCAAACTCATTGCCGATATGGGGATTTCCGTACGCGCGCTGCTGCGT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 CGCGATGAACTGGTCAAACTCATTGCCGATATGGGGATTTCCGTACGCGCGCTGCTGCGT 180 Query 181 AAAAACGTCGAACCGTATGAGGAGCTGGGCCTTGCGGAAGATAAATTTACTGACGATCGG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 AAAAACGTCGAACCGTATGAGGAGCTGGGCCTTGCGGAAGATAAATTTACTGACGATCGG 240 Query 241 TTAATCGACTTTATGCTTCAGCACCCGATTCTGATTAATCGCCCGATTGTGGTGACGCCG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 TTAATCGACTTTATGCTTCAGCACCCGATTCTGATTAATCGCCCGATTGTGGTGACGCCG 300 Query 301 CTGGGAACTCGCCTGTGCCGCCCTTCAGAAGTGGTGCTGGAAATTCTGCCAGATGCGCAA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 CTGGGAACTCGCCTGTGCCGCCCTTCAGAAGTGGTGCTGGAAATTCTGCCAGATGCGCAA 360 Query 361 AAAGGCGCATTCTCCAAGGAAGATGGCGAGAAAGTGGTTGATGAAGCGGGTAAGCGCCTG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 361 AAAGGCGCATTCTCCAAGGAAGATGGCGAGAAAGTGGTTGATGAAGCGGGTAAGCGCCTG 420 Query 421 AAATAA 426 |||||| Sbjct 421 AAATAA 426
Hình 3.7. So sánh trình tự đoạn gen phân lập từ lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos với trình tự được công bố trên ngân hàng gen NCBI (X80057.1).
Tiếp tục so sánh trình tự axit amin suy diễn của đoạn gen arsC phân lập được với trình tự axit amin của gen gốc (Hình 3.8) cho thấy có một sự thay đổi ở axit amin số 11 trong đó A (alanin) được thay bằng V(valin).
Hình 3.8. Độ tương đồng các axit amin khi so sánh 2 trình tự
Như vậy, có thể sử dụng đoạn gen arsC trong vector nhân dòng pBT-arsC
cho nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector chuyển gen.
3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen arsC3.2.1. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCambia 1301 3.2.1. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCambia 1301
Vector biểu hiện pCambia 1301 có chứa promoter CaMV 35S là một promoter mạnh dùng để biểu hiện trong tế bào thực vật. Do vậy chúng tôi chọn promotor CaMV 35S để điều khiển gen arsC phục vụ cho quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá (Hình 3.9).
Vector pCambia1301 và pBT- arsC đều chứa điểm cắt của enzyme cắt giới hạn Eco72I và NcoI. Thực hiện đồng thời phản ứng cắt pCambia1301 và pBT-arsC
với hai enzyme giới hạn trên. pCambia 1301 sau khi cắt với enzyme Eco72I và NcoI sẽ loại bỏ gen GUS, còn pBT-arsC sẽ cho ra 2 vạch băng tương ứng với vector pBT và gen arsC. Một enzyme có đầu bằng còn một enzyme có so le, như vậy đoạn gen sẽ được gắn thuận chiều với promoter trên vector tái tổ hợp. Kết quả sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% được thể hiện trên hình 3.10.
Hình 3.10. Sản phẩm cắt plasmid pCambia1301 và pBT-arsC, M: Marker Fermentas 1kb, 1: pCAMBIA1301 được cắt bởi NcoI và Eco72I, 2: pBT-arsC được cắt bởi NcoI và Eco72I
Điện di sản phẩm cắt cho thấy plasmid pCambia1301 có kích thước khoảng 11,8 kb. Plasmid này đã được cắt bằng hai enzyme NcoI và Eco72I cho 2 vạch (giếng 1), 1 vạch khoảng 9,8 kb là của vector pCambia 1301 có chứa promoter CaMV 35S, gen kháng kháng sinh hygromycin và vạch còn lại cho kích thước khoảng 2 kb tương ứng với đoạn gen GUS; PBT- arsC sau khi cắt cho 2 vạch băng, 1 vạch khoảng 2.7kb là vector pBT và 1 vạch khoảng gần 500 bp là gen arsC (giếng 2).
Gen arsC và vector pCambia1301 sau khi cắt được tiến hành tinh sạch nhằm thu lại gen mục tiêu đồng thời loại bỏ các tạp chất để cho quá trình thiết kế vector có hiệu quả cao. Khi dung dịch qua cột tinh sạch, DNA sẽ được gắn vào các phân tử có ái lực cao với chúng cố định trên màng lọc của cột. Dịch đệm cùng agarose
được loại bỏ nhờ ly tâm với tốc độ cao. DNA được thu lại bằng nước khử ion. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra trên gel agarose 1 % thể hiện trên hình 3.11
Hình 3.11. Sản phẩm tinh sạch pCambia1301 và gen arsC sau khi cắt bằng enzyme NcoI và Eco72I, M: Marker 1 kb, 1: Phân mảnh của pCambia1301 cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch), 2: gen arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch)
Kết quả sản phẩm tinh sạch (Hình 3.11) có hàm lượng cao, không bị đứt gẫy, đúng với kích thước như tính toán lý thuyết của gen arsC và vector pCambia1301 đã loại bỏ gen GUS. Chứng tỏ quá trình tinh sạch đủ điều kiện để thực hiện phản ứng lai nhờ T4 ligase tạo vector tái tổ hợp pCambia 1301-arsC.
Thực hiện phản ứng ligate đoạn gen arsC vào vector pCambia1301 (ligate qua đêm ở 22oC), sau đó biến nạp vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt và trải trên môi trường chứa chất kháng sinh kanamycin 50mg/l, nuôi ở 37oC để kiểm tra các khuẩn lạc mang cấu trúc biến nạp.
3.2.2. Kết quả kiểm tra vector pCambia 1301- arsC
Kiểm tra vector pCambia 1301- arsC bằng PCR
Các khuẩn lạc mọc trên môi trường chứa kháng sinh kanamycin 50mg/l. Do vậy theo lý thuyết thì các chủng khuẩn này phải mang vector pCambia1301 chứa gen kháng kanamycin. Tuy nhiên, chúng có thể mang các vector tự đóng vòng hoặc các gen đích bị đứt gãy vì vậy chưa chắc các khuẩn lạc này đã mang gen arsC. Để kiểm tra các khuẩn lạc mang gen arsC, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid để kiểm tra sự có mặt của vector pCambia1301. Tiếp theo tiến hành phản ứng PCR với
cặp mồi đặc hiệu và đồng thời cắt vector pCambia1301-arsC bằng enzyme NcoI,
Eco72I để kiểm tra sự có mặt của gen arsC.
Kết quả tách chiết plasmid từ các chủng biến nạp được thể hiện trên hình 3.12.
Hình 3.12: Kết quả tách chiết plasmid pCambia1301-arsC, M: Marker Fermentas 1kb, 1-4: plasmid tách từ khuẩn lạc sau khi biến nạp
Tiến hành phản ứng PCR pCambia1301-arsC với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển nạp. Đối chứng âm là plasmid pCambia1301 không mang gen arsC. Kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%.
Hình 3.13: Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen arsC,M:Marker Fermentas 1kb, ĐC: Sản phẩm PCR với khuôn là pCambia 1301, 1-4: Sản phẩm PCR với khuôn là pCambia 1301 - arsC sau biến nạp
Hình 3.13 cho thấy các mẫu 2, 3, 4 cho kết quả dương tính. Vạch băng có kích thước khoảng gần 500bp đúng với kích thước của gen arsC. Mẫu 1 cho kết quả âm tính.
Kiểm tra vector pCambia 1301-arsC bằng enzyme cắt giới hạn
Để khẳng định thêm sự có mặt của gen arsC chúng tôi tiến hành phản ứng cắt pCambia1301- arsC với enzyme NcoI và Eco72I. Kết quả của phản ứng cắt như sau:
Hình 3.14. Sản phẩm cắt pCambia1301-arsC bằng enzyme NcoI và Eco72I, M: Marker Fermentas 1kb, 1-3: Sản phẩm cắt pCambia 1301 - arsC bằng enzyme NcoI và Eco72I.
Kết quả điện di của phản ứng cắt cho văng ra 2 vạch băng tương ứng với plasmid pCambia1301 đã loại bỏ gen GUS (kích thước khoảng 9.8 kb) và gen arsC
(khoảng gần 500bp) theo như tính toán lý thuyết. Như vậy, kết luận được gen arsC
đã được biến nạp thành công vào vector biểu hiện pCambia1301.
Từ kết quả kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen arsC
và phản ứng cắt bằng 2 enzyme NcoI và Eco72I, chúng tôi có thể khẳng định vector pCambia1301 - arsC đã được thiết kế thành công.
3.3. Biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301-arsC vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58.
Tiến hành biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301- arsC vào chủng vi khuẩn A.tumefaciens C58. Chuẩn bị 50µl tế bào A.tumefaciens khả biến và trộn vào 5µl plasmid pCambia1301-arsC đã tinh sạch. Thực hiện phản ứng biến nạp plasmid vào tế bào A.tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Đây là một phương pháp khá hiệu quả trong một thời gian ngắn. Sau đó nuôi phục hồi tế bào và cấy trải trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50µg/ml và rifamycin 50µg/ml ở 28o C trong 2 ngày.
Các khuẩn lạc có thể phát triển trên môi trường kháng sinh chọn lọc nên có thể kết luận chúng mang gen kháng kanamycin. Tuy nhiên, chúng chưa chắc đã mang gen đích như mong muốn vì có thể chứa các plasmid tự đóng vòng. Do đó chúng tôi sử dụng phương pháp Colony- PCR với khuôn là khuẩn lạc để chọn lọc các dòng mang gen mong muốn. Chọn 10 dòng khuẩn lạc tròn, nằm riêng rẽ thực hiện phản ứng Colony – PCR. Kết quả điện di kiểm tra được biểu hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15. Kết quả phản ứng Colony- PCR của 10 khuẩn lạc A.tumefaciens
C58 được biến nạp pCambia1301- arsC, M: Marker Fermentas 1Kb, 1-10: Sản phẩm Colony - PCR các dòng khuẩn lạc A. Tumefaciens sau biến nạp, ĐC: Sản phẩm Colony -PCR dòng khuẩn lạc A.Tumefaciens chưa biến nạp gen arsC.
Kết quả trên cho thấy, cả 10 dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính và cho cùng kích thước là khoảng gần 500 bp đúng với kích thước của gen arsC. Đối chứng âm là khuẩn lạc A.Tumefaciens không mang gen arsC không cho vạch băng nào. Như vậy, vector pCambia1301-arsC đã được chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens. Tiếp theo, 10 dòng khuẩn lạc A. tumefaciens này được chúng tôi sử dụng làm nguồn nguyên liệu để chuyển gen arsC vào cây thuốc lá.
3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen arsC
Sau khi tham khảo các công trình để tìm hiểu sự ảnh hưởng của vật liệu biến nạp (cuống hay mảnh lá), kích thước mảnh lá, tuổi cây thuốc lá, mật độ tế bào vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen, chúng tôi tiến hành biến nạp chủng vi khuẩn