4. Chuyển gen ở thực vật
2.3.6. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmid của vi khuẩn
Hoá chất sử dụng
Dung dịch I: 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8 Dung dịch II: 0,2 N NaOH, 1% SDS
Dung dịch III: 60 ml kali acetate 5M, 28,5 ml H2O
Dung môi loại protein: Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25:24:1), chloroform : isoamyl alchohol (24:1), TE 0,01M pH 8,0
Quy trình
Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli vào 3 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc qua đêm ở 37oC, 200 vòng/phút. Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào các ống Eppendorf và đem ly tâm 8.000 vòng/phút, 5phút, 4oC để thu tế bào. Tủa thu được hoà trong 100 µl dung dịch sol I. Bổ sung ngay 200 µl dung dịch II, đảo nhẹ nhàng. Sau đó bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III. Thêm 550 µl dung dịch chloroform : isoamyl alchohol ( 24 : 1), đảo nhẹ nhàng. Ly tâm 12.000 vòng/phút, 4oC, 15 phút. Chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf mới và tủa bằng isopropanol. Để lạnh -20oC trong 20 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút để thu plasmid. Rửa cặn bằng 0,5 ml cồn 70%, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, làm khô và hoà cặn trong 30 µl nước đề ion, giữ ở -20oC. Bổ sung RNase nồng độ 100 µg/ml vào mẫu. Ủ mẫu ở 37oC trong 2 giờ. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra DNA.
Tinh sạch DNA
Điện di trên gel agarose, nhuộm, soi trên bàn soi UV và cắt lấy đoạn gel chứa đoạn DNA quan tâm cho vào ống eppendorf. Bổ sung dịch gắn kết DNA (Gel Binding) vào ống chứa mảnh gel, Với phương pháp thôi gel: tỉ lệ Vmẫu : VGB = 1 : 5, đối với phương pháp tinh sạch Vmẫu : VGB = 1 : 1. Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút và cứ 2 - 3 phút đảo nhẹ một lần cho đến khi gel tan hoàn toàn. Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA (Binding column) và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 400 µl đệm rửa Washing Buffer lên cột liên kết DNA. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Có thể ly tâm 2 lần để loại bỏ hoàn toàn đệm rửa Washing Buffer. Để khô 5 phút bay cồn. Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung 30-50 µl dung dịch hòa tan DNA (Elution Buffer) (hoặc nước khử ion đã khử trùng) vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA. Bỏ cột và bảo quản DNA vừa tinh sạch ở -20oC.