4. Chuyển gen ở thực vật
2.3.2. Phương pháp tách ARN
Mẫu được nghiền trong dung dịch Nito lỏng, sau đó được bổ sung tác nhân gây biến tính protein mạnh và hiệu quả là 2-mercaptoethanol. Chất này có tác dụng ức chế hoạt động của các RNase nội bào và tách các protein liên kết ra khỏi RNA. Loại bỏ các protein ra khỏi mẫu bằng cách xử lý phenol-chloroform-isoamyl alcohol rồi li tâm, để kết tủa protein và cặn bã còn nucleic axit sẽ hòa tan ở phần trên. Kết tủa nucleic axit bằng cách thêm lượng ethanol dư thừa. Tránh sự phân hủy RNA bằng cách dùng 3M LiCl và DEPC – H2O. Vì phương pháp sử dụng Trizol không thu được ARN đối với cây dương xỉ vì vậy phương pháp thủ công bắt buộc phải sử dụng trong công đoạn này.
Quy trình:
Nghiền 100mg lá trong Nito lỏng bằng cối sứ để phá vỡ vách tế bào. Bột đã nghiền cho vào ống ly tâm 1,5ml.
Bổ sung 500 µl Extraction Buffer, 100 µl 2-mercapethanol và 500 µl phenol- chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1)
Voltex 5 phút, ly tâm 8.000 vòng/ phút trong 10 phút
Thu dịch nổi sang ống mới. Bổ sung lượng phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) với tỉ lệ 1:1. Lắc ống nhẹ nhàng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 8.000 vòng/ phút trong 10 phút.
Chuyển lớp trên sang ống eppendorf 1.5 ml rồi bổ sung isopropanol với tỉ lệ 1:1, 25 µl NaCl 5M, sau đó lắc nhẹ nhàng.
Bổ sung 900 µl DEPC – H2O và 200 µl LiCl 3M
Ủ 30 phút ở -20oC, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu phần tủa Bổ sung 500 µl Ethanol 70%. Voltex nhẹ
Thu phần tủa. Bổ sung 200 µl DEPC – H2O và 200 µl LiCl 3M, 20 µl 3M Sodium acetate, 500 µl Ethanol 100%. Voltex nhẹ
Ủ 30 phút ở -20 o
C, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa Bổ sung 500 µl Ethanol 70%. Voltex. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa
Bổ sung 30 µl DEPC – H2O. Ủ 55-60oC trong 5 phút để RNA tan hoàn toàn.