4. Chuyển gen ở thực vật
3.5. Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR
Các dòng thuốc lá chuyển gen quan tâm được tiến hành kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây bằng phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu arsC-NcoI/F và
arsC-Eco72I/R. Nếu kết quả nhận được gen đặc hiệu với kích thước đúng như tính toán ban đầu thì có thể kết luận cây có mang gen chuyển. Sản phẩm điện di DNA tổng số của các cây thuốc lá chuyển gen cho các băng đều và rõ nét, đủ điều kiện cho phản ứng PCR. Kết quả nhân gen arsC thể hiện trên hình 3.20.
Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng thuốc lá chuyển gen, 1 – 24: Sản phẩm PCR của các dòng thuốc lá chuyển gen 1-20, M: Marker Fermentas 1kb
Kết quả cho thấy trong số 20 dòng thuốc lá chuyển gen arsC sau 1 tháng trồng ngoài tự nhiên kiểm tra bằng phản ứng PCR thu được 15 dòng có kết quả dương tính với vạch băng kích thước khoảng gần 500bp phù hợp với kích thước lý thuyết của gen arsC. Bước đầu chứng tỏ được gen arsC đã được chuyển thành công vào 15 dòng thuốc lá trên.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
- Đã tách và nhân dòng thành công gen arsC từ cây dương xỉ Pytirogramma calomelanos .
- Thiết kế được vector chuyển gen pCambia 1301-arsC mang gen gen arsC. - Đã tạo được 20 dòng thuốc lá chuyển gen mang gen arsC sống sót trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc Cefotaxime và Hygromycin.
- Nhận được 15 cây dương tính trong tổng số 20 cây thuốc lá nhận được sau chuyển gen khi kiểm tra sự có mặt của gen arsC bằng PCR.
Kiến nghị
- Cần đánh giá cây thuốc lá chuyển gen bằng một số phương pháp khác để khẳng định chắc chắn sự có mặt của gen arsC trong cây chuyển gen (lai Southern Blot, khả năng tích lũy As…)
- Cần đánh giá tính ổn định di truyền ở các thế hệ sau của các dòng thuốc lá mang gen arsC thu được.
- Dựa trên những kết quả nghiên cứu của đề tài và điều kiện của từng vùng ô nhiễm cụ thể có thể tiếp tục tạo những cây trồng chuyển gen khác nhằm mục đích cải tạo môi trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Abernathy C. O.;Calderon R. L. and Chappell W.R. (1997). "Arsenic Exposure and Health Effects." Chapman and Hall, London, England.
2. Aposhian H. V. (2001). "DMPS increases the urinary excretion of arsenic in humans." Arsenic Exposure and Health Effects. Proceedings of the 2000 Conference. Elsevier, Amsterdam.
3. Aposhian H.V et al (2001). "Methyllarsonous acid (MMA), the most toxic and neglected biotransformant of inorganic arsenic. Arsenic Exposure and Health Effects." Proceedings of the 2000 Conference.
4. Barcelos J. ; Poschenrieder C. (2003). "Phytoremediation: principles and perspectives." Contributions to Science: 333 – 344.
5. Bencko V. (1997). "Health aspects of burning coal with a high arsenic content: the central Slovakia experience." Arsenic Exposure and Health Effects.
6. Borum D.R. ; Abernathy C.O. (1994). "Human oral exposure to inorganic arsenic." Arsenic Exposure and Health Effects. Science and Technology Letters, Northwood, England.
7. Thị Kim Anh (2011). "Nghiên cứu sử dụng thực vật (dương xỉ) để xử lý ô nhiễm Asen trong đất vùng khai thác khoáng sản, Luận án Tiến sĩ Môi trường đất và nước, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội."
8. Burns R. G; Rogers S.; McGhee I (1996). "In Contaminants and the Soil Environment in the Australia Pacific Region." Kluwer Academic Publishers: 361-410
9. Cebrian M.E. ; Aposhian H.V. (2001). "Assesment of arsenic body burden. The role of the DMPS challenge test." Arsenic Exposure and Health Effects. Proceedings of the 2000 Conference. Elsevier, Amsterdam.
10. Chappell W.R.;Abernathy C.O. and Calderon R.L. (1999). "Arsenic Exposure and Health Effects." Elsevier, Amsterdam.
11. Chilton M.D. (1993). "Agrobacterium gene transfer." Progress on a poor man's vector 90: 3119-3210.
12. Choprapawon C. ; Ajjimangkul S. (1999). "Major interventions on chronic arsenic poisoning in Ronpibool District, Thailand- review and long-term follow-up " Arsenic Exposure and Health Effects.
13. Choprapawon C. ; Rodcline A. (1997). "Chronic arsenic poisoning in Ronpibool Nakhon Sri Thammarat, the southern province of Thailand." Arsenic Exposure and Health Effectts.
14. Chowdhurry T.R. (1997). " Arsenic in groundwater in six districts of West Bengal." Arsenic Exposure and Health Effects.
15. Chowdhurry T.R. et al (1999). "Groundwater arsenic contamination and the suffering of people in Bangladesh." Arsenic Exposure and Health Effects.
16. Curie C.; Alonso J.M.; Le Jean M.; Rcker J.R.; Briat J.F. (2000). "Involvement of Nramp1 from Arabidopsis thaliana in ion transport." Biochem J 347: 749-755.
17. Đặng Đình Kim (2010). "Báo cáo tổng kết kết quả khoa học công nghệ đề tài nghiên cứu sử dụng thực vật để cải tạo đất bị ô nhiễm kim loại nặng tại các vùng khai thác khoáng sản, Chương trình KHNC cấp Nhà Nước KC08, Bộ Khoa học và Công nghệ.".
18. Đặng Đình Kim (2012). "Nghiên cứu sử dụng thực vật để xử lý một số kim loại nặng trong đất tại các vùng khai thác mỏ." Chuyên đề bảo vệ môi trường trong khai thác khoáng sản.
19. De la Fuente J.M.;Ramirez-Rodriguez V.;Carbera-Ponce J.L. (1997). " Aluminum tolerance in transgenic plants by alteration of citrate synthesis." (Science 276): 1566-1568.
20. Dhankher O.P.; Li Y.; Rosen B.P.; Shi J.; Salt D.; Senecoff J.F.; Sashti N.A.; Meagher R.B. (2002). "Engineering tolerance and hyperaccummulation of Arsenic in plants by combining Arsenate reductase and g-glutamylcysteine synthase expression." Nature Biotechnology(20): 1140-1145.
21. Diệp Thị Mỹ Hạnh (2007). "Thực vật có khả năng hấp thu Pb trong đất để giải ô nhiễm." Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ (1).
23. Đồng Thị Minh Hậu ; Hoàng Thị Thanh Thủy ; Đào Phú Quốc (2008). "Nghiên cứu và lựa chọn một số thực vật có khả năng hấp thu các kim loại nặng (Cr, Cu, Zn) trong bùn nạo vét kênh Tân hóa- Lò gốm." Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ(4).
24. Ellis D.R.; Gumaelius L.; Indriolo E.; Pickering I.J.; Bank J.A.; Salt D.E. (2006). "A novel arenas reductase from the Arsenic hyperaccummulating fern Pteris vittata." Plant Physol (141): 1544-1554.
25. Folks D. J. (2001). "Impacts of historic arsenical pesticide use on residential soils in Denver, Colorado." Arsenic Exposure and Health Effects. Proceedings of the 2000 Conference.
26.Guha Mazumder D. N. et al (2001). "Treatment of chronic arsenic toxicity." Arsenic Exposure and Health Effects. Proceedings of the 2000 Conference. Elsevier, Amsterdam.
27. Guo H. R. and Greene H. L (1994). " Arsenic in drinking water and cancers: a brief descriptive review of Taiwan Studies." Arsenic Exposure and Health Effects.Science and Technology Letters. Northwood, England.
28. Hanif M. (2004). "Chracterization of small GTPase Cdc42 from the ectomycorrhizal fungus Suillus bovinus and Agrobacterium tumefaciens " University of Helsinki.
29. Hasegawa I.; Terada E.; Sunairi M.; wakita H.; Shinmachi F.; Noguchi A.; Nakajima M.; Yazaki J. (1997). "Genetic improvement of heavy metal tolerance in plants by transfer of the yeast metallothionein gene (CUP1)." Plant Soil 277-281.
Hirschi K.D.;Zhent R.; Cunningham K.W. (1996). "CAX1, an HI/Ca2+ antiporter from Arabidopsis." 8782-8786.
30. Hoàng Thị Thanh Thủy ; Từ Thị Cẩm Loan ; Nguyễn Như Hà Vy (2007). "Nghiên cứu địa hóa môi trường một số kim loại nặng trong trầm tích sông rạch Tp Hồ Chí Minh." Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ(1).
31. Jerald L. Schnoor (2002). "Phytoremediation Of Soil And Groundwater." Center for Global and Regional Environmental Research and Dept. of Civil and Environmental Engineering.
32. Kilburn K. H. (1997). "Neurobehavioral impairment from long-term residential arsenic exposures." Arsenic Exposure and Health Effects.
33. Lâm Minh Triết ; Lê Huy Bá (2006). "Sinh thái môi trường học cơ bản." Nxb Đại học Quốc gia TPHCM 576.
34. Lê Thanh Hòa (2003). "Sinh học phân tử virus Gumboro, nghiên cứu ứng dụng tại Việt Nam." Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
35. Lê Thị Thu Hiền (2003). "Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumfaciences mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng." Luận án tiến sĩ, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
36. Lê Trần Bình ; Phan Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn (2003). "Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam." Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
37. Liao X (2004). "Root distributions and elemental accumulations of Chinese brake (Pteris vittata L.) from As-contaminated soils." Plant and Soil 109–116.
38. Ma J. Q. ; Komar M. ; Zhang T.W .; Cai Y. ; Kenelley E.D. (2001). "A fern that hyperaccumulaters Arsenic." Nature: 509.
39. Michielse B. C ; Hooykaas P. J. J. (2008). "Agrobacterium – mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus awamori."
40. Murcott S. (2001). "A comprehensive review of low-cost, well-water treatmen technologies for arsenic removal " Proceedings of the 2000 Conference.
41. Nguyễn Đình Tuấn (2005). "Chất lượng nước kênh rạch tại Tp Hồ Chí Minh - Hiện trạng và thách thức." Báo cáo hội thảo “Phát triển bền vững thành phố xanh trên lưu vực sông”: 8 - 9.
42. Nguyễn Đức Thành (2003). "Chuyển gen ở thực vật." Nxb Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.
43. Nguyễn Khắc Hải (2006). "Ảnh hưởng của ô nhiễm asen trong nguồn nước sinh hoạt đến sức khỏe con người." Thông tin KHCN.
44. Nguyễn Tiến Cư ; Trần Văn Tựa ; Đặng Đình Kim ; Đỗ Tuấn Anh ; Lê Thu Thủy (2007). "Nghiên cứu khả năng xử lý chì (Pb) trong đất ô nhiễm bằng cây cỏ Vetiver zizannioides." Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường.: 308- 312.
45. Phạm Văn Khang; Nguyễn Ngọc Minh; Nguyễn Xuân Huân (2004). "Một số nghiên cứu về kim loại nặng trên thế giới." Tạp chí khoa học đất(20): 157- 161.
46. Pilon-Smits E. (2005). "Phytoremediation." Annu. Rev. Plant Biol 56: 15-39.
47. Prasad M.N.V.; Freitas H.O. (2003). "Metal hyper accumulation in plant – Biodiversity prospecting for phytoremendiation technology." J of Biotech(3): 285-321
48. Raskin I.; Smith R.D.; Salt D.E. (1997). "Phytoremediation of metals: Using plants to remove pollutants from the environment." Curr. Opin. Biotechnol(2): 221-226.
49. Sabarrinath S.; Shan W.; Lena Q. M.; Bala R. (2009). "Expression of a Pteris vittata glutaredoxin PvGRX5 in transgenic Arabidopsis thaliana increases plant arsenic tolerance and decreases arsenic accumulation in the leaves." Plant, Cell and Environment(32): 851–858.
50. Sancha A.M. (1999). "Full-scale application of coagulation processes for arsenic removal in Chile: a successful case study." Arsenic Exposure and Health Effects.
51. Sasieni P. ; Evans S. ; Cuzick J. (1994). "Long term follow-up of patients treated with medicinal arsenic." Arsenic Exposure and Health Effects. Science and Technology Letters, Northwood, England.
52. Saxena PK. (1999). "Phytoremediation of heavy metal contaminated and polluted soils." MNV prasad & J Hagemayr (eds) Heavy metal stress on plants, From molecules to ecosystems, Springer Verlag, Berlin: 305-329.
53. Saxena PK. et al (1999). "Phytoremediation of heavy metal contaminated and polluted soils." MNV prasad & J Hagemayr (eds) Heavy metal stress on plants, From molecules to ecosystems, Springer Verlag, Berlin: 305-329.
54. Schat H. et al (1999). "Metal specific patterns of tolenrance, uptake, and transport of heavy metals in hyperaccumulating and non-hyperaccumulating metallophytes." Phytoremediation of contaminated soils and waters: 171-188.
55. Styblo M. and Lin S. (2001). "Toxic consequences of the metabolism of arsenic. Arsenic Exposure and Health Effects." Proceedings of the 2000 Conference.
56. Sun G.F. (1999). "The present situation of chronic arsenism and research in China." Arsenic Exposure and Health Effects.
57. Sun H. H.; Sun A.C.; Hyeon Y; Kyung-Suk C. (2011). "Screening of Cucumis sativus as a new arsenic-accumulating plant and its arsenic accumulation in hydroponic culture." Environ Geochem Health: 143–149.
58. Thomas D. J. et al (2001). "Dore-response relations for the excretion of methylated arsenicals in urine by individuals chronically exposed to inorganic arsenic." Proceedings of the 2000 Conference.
59. Timothy Oppelt E. (2000). " Introduction to Phytoremediation." National Risk Management Research Laboratory, Office of Research and Development, U.S. Environmental Protection Agency.
60. Trần Văn Tựa ; Nguyễn Đức Thọ ; Đỗ Tuấn Anh ; Nguyễn Trung Kiên ; Đặng Đình Kim (2007). "Sử dụng cây sậy và cỏ vetiver trong xử lý nước thải chứa Cr và Ni theo phương pháp vùng rễ." Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường.: 29.
61. Van de Zaal B.J.; Neuteboom L.W.; Pinas J.E.; Chardonnens S.; Schat H.; Verkleij J.A.; Hooykaas.C. (1999). "Over expression of a novel Arabidopsis gene related to putative zinc transporter genes from animal can lead to enhanced zinc resistance and accumulation." Plant Physiol: 1047-1055.
62. Vũ Quyết Thắng (1998). "Hàm lượng kim loại nặng trong đất và rau muống Thanh Trì." Tạp chí hoạt động khoa học: 31-32.
63. Willard Chappell (1999). "Arsenic Exposure and Health Effects V." Gulf Professional Publishing 5.
64. Yadav R.; Arora P.; Kumar S. (2010). "Perspectives for genetic engineering of poplars for enhanced phytoremediation abilities." Ecotoxicology(19): 1574–1588.
65. Yoshihiro Narusaka ; Mari Narusaka ; Satoshi Yamasaki ; Masaki Iwabuchi (2012). "Transgenic Plants - Advances and Limitations." Agricultural and Biological Sciences(9).
66. Zhu Y.;Pilon-Smits E.A.H.; Jouanin L.; and Terry N. (1999). "Over expression of glutathione synthetase in Brassica juncea enhances Cadmium tolerance and accumulation." Plat Physiol 119: 73-79.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Sơ đồ vector tách dòng pBT
Phụ lục 3: Danh mục hóa chất và nồng độ sử dụng trong tách chiết ADN và plasmid Hóa chất Nồng độ Tris-HCl 25 mM EDTA 10 mM Glucose 50 mM NaOH 0,2 N SDS 1 % Potassium acetat 3M Acetic acid 11,5% Ethanol 70 % Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Phụ lục 4: Thành phần và chu trình phản ứng PCR Thành phần Thể tích 1 phản ứng Chu kì nhiệt
H2O 10.5 Nhiệt độ Thời gian
Dream Taq Buffer 2 94 oC 5 phút
dNTP 4 94 oC 50 giây
Reverse Primer 1 55 oC 50 giây 35 chu
kì
Forward Primer 1 72oC 1 phút 30giây
Taq 0.5 72 oC 10 phút
Sample 1
Tổng thể tích 20
Phụ lục 5: Quy trình điện di DNA trên gel agarose
Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường độ thích hợp
Chuẩn bị gel agarose: cho 1g agarose vào 100 ml dung dịch TBE 1X, lắc đều và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội đến khoảng 50 – 60oC, đổ dung dịch vào khay điện di có cài sẵn răng lược, để gel đông cứng, rút lược và đặt bản gel vào bể điện di, đổ dung dịch TBE ngập bản gel từ 1 - 2 mm. Tra mẫu và chạy điện di: mẫu DNA được trộn với đệm tra mẫu, mix đều và tra vào giếng, chạy điện di với thang DNA chuẩn để xác định trọng lượng phân tử DNA.
Nhuộm bản gel: bản gel được lấy ra khỏi khuôn, ngâm 15 - 20 phút trong dung dịch Ethidium Bromide, rửa lại bằng nước và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA, ảnh được chụp bằng máy soi gel.
Phụ lục 6: Quy trình chuyển gen quan tâm vào thuốc lá cải tiến (Toopping, 1998)
1. Chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa gen quan tâm được bảo quản trong glycerol -80oC được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc, nuôi tối ở 28oC trong 2 ngày.
2. Cây con in vitro phát triển 3-4 lá thật, chọn các lá bánh tẻ để tiến hành biến nạp. Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1 cm2 trong môi trường ½ MS lỏng và đặt lên môi trường cảm ứng GM (MS + 1mg/l BAP).
3. Một ngày trước khi biến nạp, chọn khuẩn lạc tròn đều, đứng độc lập nuôi lỏng trong 10 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi qua đêm (16 giờ). Sau đó nuôi phục hồi thêm 4 giờ trong 50 ml LB không bổ sung kháng sinh chọn lọc.
4. Biến nạp:
- Khuẩn sau khi nuôi được đem đo OD600= 0,6-1 thì sử dụng để biến nạp.
- Đem ly tâm lạnh thu cặn khuẩn, cặn khuẩn được hòa tan với dung dịch ½ MS để tạo dịch huyển phù vi khuẩn.
- Các mảnh lá sau 2 ngày nuôi cấy cảm ứng trên môi trường GM được chuyển sang b ình tam giác có chứa dung dịch ½ MS lỏng và dịch huyền phù vi khuẩn.
5. Sau 30 phút chuyển các mảnh lá lên giấy thấm tiệt trùng, thấm khô và cấy lên môi trường GM không có kháng sinh, đồng nuôi cấy 2 ngày.
6. Sau 2 ngày, cấy chuyển các mảnh lá sang môi trường chọn lọc chồi 1 GM có bổ sung Cefotaxime 500mg/l và Hygromycin 5mg/l.
7. Sau 2-3 tuần, các mảnh lá bắt đầu được cảm ứng tạo mô sẹo tiếp tục được chuyển sang môi trường chọn lọc chồi 1 GM có bổ sung Cefotaxime 500mg/l + Hygromycin 5mg/l.
8. Sau 4 tuần, các mảnh lá đã tạo chồi được chuyển sang môi trường chọn lọc chồi 2 GM có bổ sung 500 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hygromycin.
9. Sau khi tạo đa chồi, các chồi phát triển tốt được chuyển sang môi trường tạo rễ RM có bổ sung 500 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hygromycin.
10. Cây con ra rễ nhiều, cao 5-7 cm thì được đua ra bầu chứa giá thể đất : trấu : cát (1:1:1).
11. Sau 2 tuần, cây phát triển ổn định, tiến hành kiểm tra cây sau chuyển gen.