4. Chuyển gen ở thực vật
3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen arsC
Vector biểu hiện pCambia 1301 có chứa promoter CaMV 35S là một promoter mạnh dùng để biểu hiện trong tế bào thực vật. Do vậy chúng tôi chọn promotor CaMV 35S để điều khiển gen arsC phục vụ cho quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá (Hình 3.9).
Vector pCambia1301 và pBT- arsC đều chứa điểm cắt của enzyme cắt giới hạn Eco72I và NcoI. Thực hiện đồng thời phản ứng cắt pCambia1301 và pBT-arsC
với hai enzyme giới hạn trên. pCambia 1301 sau khi cắt với enzyme Eco72I và NcoI sẽ loại bỏ gen GUS, còn pBT-arsC sẽ cho ra 2 vạch băng tương ứng với vector pBT và gen arsC. Một enzyme có đầu bằng còn một enzyme có so le, như vậy đoạn gen sẽ được gắn thuận chiều với promoter trên vector tái tổ hợp. Kết quả sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% được thể hiện trên hình 3.10.
Hình 3.10. Sản phẩm cắt plasmid pCambia1301 và pBT-arsC, M: Marker Fermentas 1kb, 1: pCAMBIA1301 được cắt bởi NcoI và Eco72I, 2: pBT-arsC được cắt bởi NcoI và Eco72I
Điện di sản phẩm cắt cho thấy plasmid pCambia1301 có kích thước khoảng 11,8 kb. Plasmid này đã được cắt bằng hai enzyme NcoI và Eco72I cho 2 vạch (giếng 1), 1 vạch khoảng 9,8 kb là của vector pCambia 1301 có chứa promoter CaMV 35S, gen kháng kháng sinh hygromycin và vạch còn lại cho kích thước khoảng 2 kb tương ứng với đoạn gen GUS; PBT- arsC sau khi cắt cho 2 vạch băng, 1 vạch khoảng 2.7kb là vector pBT và 1 vạch khoảng gần 500 bp là gen arsC (giếng 2).
Gen arsC và vector pCambia1301 sau khi cắt được tiến hành tinh sạch nhằm thu lại gen mục tiêu đồng thời loại bỏ các tạp chất để cho quá trình thiết kế vector có hiệu quả cao. Khi dung dịch qua cột tinh sạch, DNA sẽ được gắn vào các phân tử có ái lực cao với chúng cố định trên màng lọc của cột. Dịch đệm cùng agarose
được loại bỏ nhờ ly tâm với tốc độ cao. DNA được thu lại bằng nước khử ion. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra trên gel agarose 1 % thể hiện trên hình 3.11
Hình 3.11. Sản phẩm tinh sạch pCambia1301 và gen arsC sau khi cắt bằng enzyme NcoI và Eco72I, M: Marker 1 kb, 1: Phân mảnh của pCambia1301 cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch), 2: gen arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch)
Kết quả sản phẩm tinh sạch (Hình 3.11) có hàm lượng cao, không bị đứt gẫy, đúng với kích thước như tính toán lý thuyết của gen arsC và vector pCambia1301 đã loại bỏ gen GUS. Chứng tỏ quá trình tinh sạch đủ điều kiện để thực hiện phản ứng lai nhờ T4 ligase tạo vector tái tổ hợp pCambia 1301-arsC.
Thực hiện phản ứng ligate đoạn gen arsC vào vector pCambia1301 (ligate qua đêm ở 22oC), sau đó biến nạp vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt và trải trên môi trường chứa chất kháng sinh kanamycin 50mg/l, nuôi ở 37oC để kiểm tra các khuẩn lạc mang cấu trúc biến nạp.
3.2.2. Kết quả kiểm tra vector pCambia 1301- arsC
Kiểm tra vector pCambia 1301- arsC bằng PCR
Các khuẩn lạc mọc trên môi trường chứa kháng sinh kanamycin 50mg/l. Do vậy theo lý thuyết thì các chủng khuẩn này phải mang vector pCambia1301 chứa gen kháng kanamycin. Tuy nhiên, chúng có thể mang các vector tự đóng vòng hoặc các gen đích bị đứt gãy vì vậy chưa chắc các khuẩn lạc này đã mang gen arsC. Để kiểm tra các khuẩn lạc mang gen arsC, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid để kiểm tra sự có mặt của vector pCambia1301. Tiếp theo tiến hành phản ứng PCR với
cặp mồi đặc hiệu và đồng thời cắt vector pCambia1301-arsC bằng enzyme NcoI,
Eco72I để kiểm tra sự có mặt của gen arsC.
Kết quả tách chiết plasmid từ các chủng biến nạp được thể hiện trên hình 3.12.
Hình 3.12: Kết quả tách chiết plasmid pCambia1301-arsC, M: Marker Fermentas 1kb, 1-4: plasmid tách từ khuẩn lạc sau khi biến nạp
Tiến hành phản ứng PCR pCambia1301-arsC với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển nạp. Đối chứng âm là plasmid pCambia1301 không mang gen arsC. Kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%.
Hình 3.13: Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen arsC,M:Marker Fermentas 1kb, ĐC: Sản phẩm PCR với khuôn là pCambia 1301, 1-4: Sản phẩm PCR với khuôn là pCambia 1301 - arsC sau biến nạp
Hình 3.13 cho thấy các mẫu 2, 3, 4 cho kết quả dương tính. Vạch băng có kích thước khoảng gần 500bp đúng với kích thước của gen arsC. Mẫu 1 cho kết quả âm tính.
Kiểm tra vector pCambia 1301-arsC bằng enzyme cắt giới hạn
Để khẳng định thêm sự có mặt của gen arsC chúng tôi tiến hành phản ứng cắt pCambia1301- arsC với enzyme NcoI và Eco72I. Kết quả của phản ứng cắt như sau:
Hình 3.14. Sản phẩm cắt pCambia1301-arsC bằng enzyme NcoI và Eco72I, M: Marker Fermentas 1kb, 1-3: Sản phẩm cắt pCambia 1301 - arsC bằng enzyme NcoI và Eco72I.
Kết quả điện di của phản ứng cắt cho văng ra 2 vạch băng tương ứng với plasmid pCambia1301 đã loại bỏ gen GUS (kích thước khoảng 9.8 kb) và gen arsC
(khoảng gần 500bp) theo như tính toán lý thuyết. Như vậy, kết luận được gen arsC
đã được biến nạp thành công vào vector biểu hiện pCambia1301.
Từ kết quả kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen arsC
và phản ứng cắt bằng 2 enzyme NcoI và Eco72I, chúng tôi có thể khẳng định vector pCambia1301 - arsC đã được thiết kế thành công.
3.3. Biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301-arsC vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58.
Tiến hành biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301- arsC vào chủng vi khuẩn A.tumefaciens C58. Chuẩn bị 50µl tế bào A.tumefaciens khả biến và trộn vào 5µl plasmid pCambia1301-arsC đã tinh sạch. Thực hiện phản ứng biến nạp plasmid vào tế bào A.tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Đây là một phương pháp khá hiệu quả trong một thời gian ngắn. Sau đó nuôi phục hồi tế bào và cấy trải trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50µg/ml và rifamycin 50µg/ml ở 28o C trong 2 ngày.
Các khuẩn lạc có thể phát triển trên môi trường kháng sinh chọn lọc nên có thể kết luận chúng mang gen kháng kanamycin. Tuy nhiên, chúng chưa chắc đã mang gen đích như mong muốn vì có thể chứa các plasmid tự đóng vòng. Do đó chúng tôi sử dụng phương pháp Colony- PCR với khuôn là khuẩn lạc để chọn lọc các dòng mang gen mong muốn. Chọn 10 dòng khuẩn lạc tròn, nằm riêng rẽ thực hiện phản ứng Colony – PCR. Kết quả điện di kiểm tra được biểu hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15. Kết quả phản ứng Colony- PCR của 10 khuẩn lạc A.tumefaciens
C58 được biến nạp pCambia1301- arsC, M: Marker Fermentas 1Kb, 1-10: Sản phẩm Colony - PCR các dòng khuẩn lạc A. Tumefaciens sau biến nạp, ĐC: Sản phẩm Colony -PCR dòng khuẩn lạc A.Tumefaciens chưa biến nạp gen arsC.
Kết quả trên cho thấy, cả 10 dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính và cho cùng kích thước là khoảng gần 500 bp đúng với kích thước của gen arsC. Đối chứng âm là khuẩn lạc A.Tumefaciens không mang gen arsC không cho vạch băng nào. Như vậy, vector pCambia1301-arsC đã được chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens. Tiếp theo, 10 dòng khuẩn lạc A. tumefaciens này được chúng tôi sử dụng làm nguồn nguyên liệu để chuyển gen arsC vào cây thuốc lá.
3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen arsC
Sau khi tham khảo các công trình để tìm hiểu sự ảnh hưởng của vật liệu biến nạp (cuống hay mảnh lá), kích thước mảnh lá, tuổi cây thuốc lá, mật độ tế bào vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen, chúng tôi tiến hành biến nạp chủng vi khuẩn
A.tumefaciens C58 đã mang vector chuyển gen pCambia1301- arsC vào mảnh lá cây thuốc lá. Trong quá trình chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens, đoạn gen ngoại lai sẽ sát nhập vào một ví trí bất kỳ trong genome của cây trồng. Ở mỗi vị trí khác nhau thì hiệu quả mà gen được đưa vào sẽ có biểu hiện khác nhau.
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành chuyển gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens theo phương pháp Topping (1998) có cải tiến với 3 lần bố trí thí nghiệm. Kết quả theo dõi quá trình tái sinh của các dòng thuốc lá qua các lần thí nghiệm và các giai đoạn chọn lọc khác nhau được thể hiện trong bảng 3.1
Bảng 3.1: Tỉ lệ tái sinh của các mẫu qua các giai đoạn Đối tượng nghiên cứu Lần chuyển gen Chọn lọc mảnh lá Chọn lọc cụm chồi Chọn lọc ra rễ (lần 1) Chọn lọc ra rễ (lần 2) Chọn lọc ra rễ (lần 3) Mảnh lá được biến nạp Agrobacterum C58 mang pCambia1301- arsC 1 55/60 (91,67%) 85/105 (80,95%) 48/85 (56,47%) 30/48 (62,50%) 22/30 (73,33%) 2 53/58 (91,38%) 79/95 (83,16%) 32/79 (40,51%) 21/32 (65,62%) 15/21 (71,43%) 3 61/65 (93,85%) 82/97 (84,54%) 49/82 (59,76%) 31/49 (63,27%) 25/31 (80,65%) TB 92,3% 82,88% 52,25% 63,80% 75,14% ĐC (+) 1 20/20 (100%) 32/35 (91,43%) 10/10 (100%) - - 2 12/12 (100%) 29/29 (100%) 10/10 (100%) - - 3 15/15 (100%) 31/31 (100%) 10/10 (100%) - - TB 100% 97,14% 100% - - ĐC (-) 1 0/15 (0%) - - - - 2 0/15 (0%) - - - - 3 0/15 (0%) - - - - TB 0% - - - -
ĐC (+): Mẫu không chuyển gen trên môi trường không bổ sung kháng sinh. ĐC (-) : Mẫu không chuyển gen trên môi trường có bổ sung kháng sinh
Cấu trúc gen chuyển pCambia1301- arsC được chuyển đồng thời với gen kháng hygromycin có khả năng tạo ra sản phẩm ức chế tác động của hygromycin được bổ sung trong môi trường chọn lọc. Do đó trong môi trường GM hygromycin 5 mg/l hoặc 10 mg/l, những mảnh lá, cụm chồi, cây không mang cấu trúc gen chuyển pCambia1301- arsC đồng thời không mang gen kháng hygromycin thì sẽ không thể tái sinh và phát triển được. Hygromycin gây ức chế quá trình sinh tổng hợp protein và các con đường sinh tổng hợp khác liên quan, trong đó có hoạt động
của lục lạp. Mảnh lá, cụm chồi, cây bị mất khả năng hấp thụ dinh dưỡng, hoạt động của lục lạp bị rối loạn dẫn đến vàng và chết dần.
Giai đoạn chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen
Theo kết quả tỉ lệ tái sinh của các mẫu (Bảng 3.1), các mảnh thuốc lá sau chuyển gen tái sinh đa chồi trên môi trường chọn lọc hygromycin 5mg/l là khá cao (92,3%/) so với đối chứng trên môi trường không bổ sung kháng sinh (100%). Trong khi đó các mảnh lá đối chứng không chuyển gen không sống sót được trên môi trường chọn lọc, vàng và chết dần.
A B C
Hình 3.16. Hình ảnh chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen
(A): Mảnh lá đối chứng trên môi trường đa chồi có bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l và kháng sinh cefotaxime 500mg/l, (B): Mảnh lá đối chứng trên môi trường không bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l và kháng sinh cefotaxime 500mg/l, (C): Mảnh lá mang cấu trúc gen chuyển arsC trên môi trường đa chồi có bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l và kháng sinh cefotaxime 500mg/l.
Giai đoạn chọn lọc cụm chồi sau chuyển gen
Những cụm chồi từ mảnh lá tái sinh đa chồi tốt được chuyển sang môi trường chọn lọc GM hygromycin 10mg/l để tăng áp lực chọn lọc, sàng lọc các cụm chồi đã có gen kháng hygromycin chuyển vào nhưng không hoạt động phiên mã, dịch mã (Hình 3.17).
Hình 3.17. Hình ảnh chồi thuốc lá trong môi trường đa chồi bổ sung hygromycin 10mg/l và cefotaxime 500mg/l
Trong môi trường tái sinh đa chồi tăng nồng độ kháng sinh hygromycin lên 10mg/l, những chồi thuốc lá không có gen chuyển vào sẽ vàng dần, không phát triển và chết. Các chồi mang gen chuyển thành công sẽ phát triển xanh tốt.
Giai đoạn chọn lọc cây tái sinh hoàn chỉnh
Dòng mang cấu trúc chuyển gen hoàn chỉnh phải có khả năng ra rễ trên môi trường chọn lọc để tạo thành cây hoàn chỉnh trong khi những chồi không chuyển gen sẽ không có khả năng ra rễ. Những chồi phát triển tốt được chuyển sang môi trường chọn lọc ra rễ (RM + hygromycin 10mg/l). Đối với thuốc lá, chồi cũng có thể ra rễ ngay trên môi trường MS nhưng tỉ lệ ra rễ ít hơn nhiều so với môi trường RM có bổ sung IBA 0,1 mg/l. Tỉ lệ ra rễ của chồi qua 3 lần chọn lọc trên môi trường RM hygromycin 10mg/l là khá cao (tỉ lệ chọn lọc lần 3 trung bình qua 3 đợt thí nghiệm là 75,14%).
A B C
Hình 3.18. Khả năng ra rễ của các chồi trên môi trường RM hygromycin 10mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, (A):Cây thuốc lá chuyển gen tái sinh hoàn chỉnh trên môi trường ra rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l. (B): Rễ cây thuốc lá chuyển gen tái sinh hoàn chỉnh trên môi trường ra rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l, (C): Cây đối chứng và cây chuyển gen cấy trên môi trường ra rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l. Như vậy có thể kết luận đã hoàn thành việc chuyển gen và chọn lọc cây in vitro sau chuyển gen. Qua các giai đoạn chọn lọc từ 183 mảnh lá trong 3 lô thí nghiệm thu được 28 dòng chuyển gen phát triển tốt, lá xanh đậm, chồi mập, rễ dài. Những dòng này sẽ được ra cây trong môi trường tự nhiên.
Giai đoạn ra cây vào giá thể đất: trấu : cát
Chọn mỗi dòng 3 cây sinh trưởng và phát triển tốt trong in vitro sau 1 tháng nuôi cấy được rửa rễ và đưa trồng trong nhà lưới trên giá thể trấu: đất: cát (tỷ lệ 1:1:1). Để cây thích nghi dần với môi trường đất và tránh mất nước đột ngột dẫn đến cây chết, sau khi đã ra cây vào bầu đất, cho vào túi ni lông sạch, ghim giữ ở phần trên túi và cho lại vào phòng nuôi cây điều khiển nhiệt độ 25-28o C, cường độ ánh sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày để cây phát triển ổn định. Sau 7 ngày đưa cây ra nhà lưới để cây thích nghi với điều kiện ánh sáng tự nhiên. Trong tổng số 28 dòng có 20 dòng cây thuốc lá phát triển tốt. Với đặc điểm là hệ rễ phụ của cây thuốc lá phát triển mạnh, có thể phát triển những đốt thân gần gốc nên tỷ lệ sống của các dòng khi vào giá thể khá cao (>71%), chứng tỏ cây thích nghi với điều kiện ngoại cảnh khá tốt (Hình 3.19).
Hình 3.19. Cây thuốc lá hoàn chỉnh được trồng trong bầu đất: trấu: cát
Như vậy, việc chuyển gen arsC vào cây thuốc lá, chọn lọc sau chuyển gen, tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc và trồng cây vào bầu đất đã đạt được kết quả bước đầu. Các dòng thuốc lá chuyển gen đã sẵn sàng cho việc đánh giá tiếp theo.
3.5. Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR
Các dòng thuốc lá chuyển gen quan tâm được tiến hành kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây bằng phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu arsC-NcoI/F và
arsC-Eco72I/R. Nếu kết quả nhận được gen đặc hiệu với kích thước đúng như tính toán ban đầu thì có thể kết luận cây có mang gen chuyển. Sản phẩm điện di DNA tổng số của các cây thuốc lá chuyển gen cho các băng đều và rõ nét, đủ điều kiện cho phản ứng PCR. Kết quả nhân gen arsC thể hiện trên hình 3.20.
Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng thuốc lá chuyển gen, 1 – 24: Sản phẩm PCR của các dòng thuốc lá chuyển gen 1-20, M: Marker Fermentas 1kb
Kết quả cho thấy trong số 20 dòng thuốc lá chuyển gen arsC sau 1 tháng trồng ngoài tự nhiên kiểm tra bằng phản ứng PCR thu được 15 dòng có kết quả dương tính với vạch băng kích thước khoảng gần 500bp phù hợp với kích thước lý thuyết của gen arsC. Bước đầu chứng tỏ được gen arsC đã được chuyển thành công vào 15 dòng thuốc lá trên.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
- Đã tách và nhân dòng thành công gen arsC từ cây dương xỉ Pytirogramma calomelanos .
- Thiết kế được vector chuyển gen pCambia 1301-arsC mang gen gen arsC. - Đã tạo được 20 dòng thuốc lá chuyển gen mang gen arsC sống sót trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc Cefotaxime và Hygromycin.