4. Chuyển gen ở thực vật
3.1.3. Biến nạp cấu trúc gen arsC vào vector tách dòng pBT
Vector pBT là vector tách dòng TA-Cloning với 2 Thyminde ở 2 đầu thuận lợi cho việc gắn gen theo cơ chế tách dòng T-A. Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR có xu hướng gắn Adenin vào mạch mới tổng hợp và không phụ thuộc vào khuôn, do vậy sản phẩm PCR do Taq polymerase tạo ra không có đầu bằng mà có một nucleotide A nhô ra ở đầu 3’. Gen arsC sau khi PCR được gắn trực tiếp vào plasmid theo cơ chế bổ sung A ở sản phẩm PCR với T ở đầu của vector pBT, hình thành liên kết T-A. Vector có chứa gen chọn lọc kháng sinh kháng ampicilin để chọn lọc các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp đồng thời loại trừ các vi khuẩn nhiễm tạp khác.
Gen arsC sau khi được khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu arsC- NcoI/F và
arsC- Eco72I/R được gắn vào vector pBT bằng phản ứng ligate ở 22oC qua đêm, biến nạp sản phẩm vào tế bào khả biến E.coliDH5α. Tế bào vi khuẩn biến nạp được nuôi phục hồi trên môi trường LB lỏng trong vòng 2 giờ. Sau đó cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung chất kháng sinh Amp (100µg/ml) để kiểm tra các chủng biến nạp. Nuôi qua đêm ở 37oC. Chọn 10 khuẩn lạc nuôi lắc trong môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh chọn lọc Amp (100µg/ml) qua đêm. Sau đó tiến hành tách chiết plasmid kiểm tra sự có mặt của pBT, đồng thời tiếp tục nuôi lỏng các dòng vi khuẩn này. Sau khi tách chiết plasmid, xử lý plasmid với Rnase, tinh sạch rồi điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả cho các băng rõ và đúng với kích thước của plasmid pBT đã biến nạp thêm gen arsC (~3.2 kb).
Hình 3.3. Kết quả tách chiết plasmid pBT- arsC, M: Marker Fermentas 1kb, 1- 10: Plasmid tách được từ các dòng khuẩn nạp sau khi biến nạp, ĐC: Mẫu đối chứng là plasmid tách từ khuẩn lạc không biến nạp