4. Chuyển gen ở thực vật
3.1.4. Kiểm tra vector pBT-arsC
Để chắc chắn sự có mặt của gen arsC trong vector tách dòng pBT chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR và cắt bằng enzyme giới hạn.
Kiểm tra vector pBT-arsC bằng phản ứng PCR
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi arsC-NcoI/F và arsC-EcoR72I/R. Mẫu đối chứng là plasmid pBT không mang gen arsC. Kết quả phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.4).
Hình 3.4. Kết quả PCR pBT-arsC với cặp mồi đặc hiệu, M: Marker Fermentas 1kb, ĐC: Sản phẩm PCR vector pBT không mang gen arsC, 1-9: Sản phẩm PCR vector pBT- arsC
Kết quả phản ứng PCR cho các băng đúng với kích thước gen arsC theo tính toán lý thuyết (gần 500bp). Để khẳng định thêm nữa sự có mặt của gen arsC trong vector pBT chúng tôi tiến hành kiểm tra đồng thời bằng các enzyme cắt giới hạn.
Kiểm tra vector pBT-arsC bằng enzyme cắt giới hạn BamHI
Vector tách dòng pBT có chứa 2 điểm cắt của enzyme BamHI ở 2 đầu gắn gen, thuận tiện cho việc kiểm tra gen gắn. Theo tính toán lý thuyết thì sản phẩm của phản ứng cắt enzyme sẽ cho hai đoạn có kích thước đoạn 1 là gen arsC và đoạn còn lại bằng với kích thước chiều dài vector pBT. Kết quả điện di sản phẩm cắt pBT-
arsC bằng enzyme BamHI (Hình 3.5) cho thấy cả 4 plasmid đều thu được các phân đoạn có các kích thước tương ứng với dự tính, chứng tỏ đã thành công trong việc nối ghép gen arsC vào vector nhân dòng pBT .
Hình 3.5. Kết quả cắt pBT-arsC bằng BamHI, M: Marker Fermentas 1kb,1-4: Sản phẩm cắt pBT-arsC bằng BamHI.
Còn một cách kiểm tra bằng enzyme NcoI và Eco72I cũng được chúng tôi tiến hành. Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại gen arsC được thiết kế với 2 điểm cắt của 2 enzyme giới hạn NcoI và Eco72I ở 2 đầu. Do vậy dễ dàng cắt pBT-arsC bằng các enzyme giới hạn NcoI và Eco72I để kiểm tra sự có mặt của gen arsC. Kết quả phản ứng cắt cho ra 2 vạch băng tương ứng với vector pBT ( khoảng 2.7kb) và gen
arsC (khoảng gần 500bp) (Hình 3.6). Như vậy hoàn toàn có thể khẳng định vector pBT-arsC đã được thiết kế.
Hình 3.6. Kết quả cắt pBT-arsC bằng NcoI và Eco72I, M: Marker Fermentas 1kb, 1-4: Sản phẩm cắt pBT- arsC bằng NcoI và Eco72I