4. Chuyển gen ở thực vật
2.3.8. Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A.tumefaciens
Topping, 1998 )
Dòng khuẩn lạc A.tumefaciens được kiểm tra là mang plasmid tái tổ hợp được bảo quản trong glyxerol ở -20oC sẽ được nuôi cấy trên môi trưởng LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc kana 50mg/l + rifa 50mg/l nuôi tối ở 28oC. Chọn một khuẩn lạc tròn đều, đứng độc lập nuôi trong 10ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc qua đêm (khoảng 16 giờ) ở 28oC, lắc 250 vòng/phút. Sau đó nuôi phục hồi dịch khuẩn trên trong LB lỏng với tỉ lệ 1:10 trong khoảng 4 giờ phục vụ cho biến nạp. Giữ lạnh khuẩn trên đá. Đo OD550 = 0.6-0.8. Sau đó li tâm lạnh ở nhiệt độ 4oC hòa tan tủa trong môi trường ½ MS để tạo dịch huyền phù vi khuẩn dùng cho biến nạp vào các mảnh thuốc lá.
Lây nhiễm
Mảnh lá được ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn để tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào mô lá. Sau 30 phút lây nhiễm, chuyển các mảnh lá lên giấy thấm đã khử trùng, thấm khô và cấy lên môi trường tạo đa chồi GM không có kháng sinh chọn lọc để tạo điều kiện cho mô lá và vi khuẩn phát triển đồng thời, nuôi trong điều kiện tối.
Chọn lọc mảnh lá và tái sinh đa chồi sau chuyển gen
Sau 2 ngày đồng nuôi cấy các mảnh lá được chuyển sang môi trường chọn lọc chồi GM có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500mg/l và hygromycin 5mg/l (Phụ lục 7) để loại bỏ các vi khuẩn còn ở bên ngoài mô lá không xâm nhập được và chọn lọc những mảnh lá có mang vi khuẩn chuyển gen. Sau 2-3 tuần, các mảnh lá bắt đầu được cảm ứng tạo mô sẹo được tách ra và cấy chuyển sang môi trường chọn lọc chồi 1. Từ những cụm chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc, chọn những cụm chồi phân hoá mạnh, tách các cụm chồi có kích thước khoảng 0,5 - 1cm2 để tiếp tục chọn lọc chồi tái sinh. Đến khi các chồi thật phát triển từ các cụm chồi thì tiến hành tách từng chồi riêng rẽ và cấy lên môi trường chọn lọc chồi 2 có bổ sung hygromycin với nồng độ cao hơn (10mg/l) để tăng áp lực chọn lọc (Phụ lục 7).
Tái sinh cây hoàn chỉnh
Từ những cụm chồi phân hoá mạnh, chọn tách những chồi độc lập, có 2 - 3 lá phân hoá rõ ràng, dài từ 2 - 3 cm cấy sang môi trường ra rễ chọn lọc (môi trường RM có bổ sung hygromycin 10mg/l, cefotaxime 500mg/l) để tạo cây hoàn chỉnh.
Thí nghiệm được đặt trong điều kiện ánh sáng điện 2000 Lux, 16 giờ sáng/8 giờ tối, nhiệt độ trong phòng duy trì ở mức 260C.
Ra cây trên giá thể trấu cát
Từ những dòng trên môi trường ra rễ chọn lọc những dòng sinh trưởng phát triển mạnh, cao 5 - 7 cm để ra cây vào giá thể trấu : cát (tỉ lệ 1:1). Sau 14 ngày chuyển các dòng vào chậu đất trong nhà lưới.
Sau khi trồng vào bầu đất, cây hồi phục và ra lá mới thì tiến hành lấy mẫu lá để phân tích cây chuyển gen.