Các phương pháp xác định vi khuẩn gây bệnh dựa trên phản ứng kháng nguyên- kháng thể đang được sử dụng khá phổ biến. Phản ứng kháng nguyên- kháng thể được xác định thông qua nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp quan sát sự kết tủa, sự ngưng kết, sự phát huỳnh quang, thông qua hoạt tính enzym hay gắn đồng vị phóng xạ [2]. Hiện nay, kháng nguyên H của B. cereus đã được sử dụng để nhận dạng vi khuẩn B. cereus bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang (Immumofluorescence) hoặc phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) [61]
Phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang: Kháng nguyên H hoặc kháng thể của B. cereus được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Nếu có phản ứng kháng nguyên- kháng thể xảy ra thì dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi được kiểm tra bởi bức xạ hoặc bước sóng đặc hiệu chúng sẽ phát quang.
Phƣơng pháp ELISA: Phương pháp này được sử dụng nhiều nhất trong việc nhận dạng cũng như phân loại kiểu huyết thanh H của B. cereus. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc gắn kháng thể với enzym. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thuỷ phân cơ chất giải phóng một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ xảy ra phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể. Phương pháp này đơn giản và có độ nhạy gấp 10-500 lần so với phương pháp ngưng kết. Ngoài ra, phương pháp này còn có thể xác định được nồng độ kháng nguyên thông qua cường độ màu. Hiện nay, không chỉ kháng nguyên H của B. cereus mà cả độc tố ruột enterotoxin của B. cereus cũng được phát hiện thông qua các phương pháp này.
1.6.3.Phƣơng pháp dựa trên đặc điểm gen
Dựa trên đặc điểm gen mã hoá các loại độc tố
Hệ gen của vi sinh vật chứa toàn bộ thông tin cần thiết cho sự sống sót và sinh trưởng của chúng. Mỗi gen mã hoá cho một protein liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp cho chu trình sống của chúng. Hiện nay cùng với sự phát triển
vượt bậc của các phương pháp sinh học phân tử đặc biệt là phương pháp PCR thì việc xác định các gen mã hóa các loại độc tố gây bệnh của vi khuẩn cũng như chính loại vi khuẩn đó trở nên dễ dàng hơn.
Như đã biết B. cereus gây ngộ độc thực phẩm với 2 thể bệnh điển hình là nôn và tiêu chảy. Thể bệnh tiêu chảy do các độc tố ruột gây ra đặc biệt là do 2 độc tố HBL và NHE. Việc phát hiện gen mã hoá cho 3 protein thành phần của phức hợp HBL cũng như NHE đã được thực hiện bằng PCR [27]. Tuy nhiên phương pháp này tỏ ra kém hiệu quả trong việc nhận dạng chính xác vi khuẩn B. cereus trong thực phẩm bởi các độc tố này cũng có thể được sinh ra bởi một số vi khuẩn khác đặc biệt là B. thuringiensis. Còn đối với các chủng B. cereus gây nôn thì dựa vào đặc điểm của độc tố gây nôn cereulide được tổng hợp không cần riboxom, người ta đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện sự có mặt của gen tổng hợp enzym NRPS có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp peptit cereulide của các chủng B. cereus gây nôn [26,41]. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ có tác dụng đặc hiệu với các chủng
B. cereus gây nôn còn không có tính đặc hiệu cho loài B. cereus.
Dựa trên trình tự rARN
Chuỗi 16S rARN có tác dụng khi xác định các loại vi khuẩn chưa biết. Nhưng trong nhóm Bacillus cereus, việc phân biệt B. cereus với các loài còn lại gặp rất nhiều khó khăn vì trình tự 16S rARN của nhóm này có mức tương đồng rất cao (99%) trong các nghiên cứa thông qua việc lai ADN-AND và phép phân tích trình tự các gen trên rARN. Trình tự 16S rARN của B. myco¿des, B. thuringiensis chỉ khác biệt với B. arthracis, B. cereus từ 0-9 nucleotit . Ngoài ra, Ash và Collins đã thông báo rằng trình tự 23S rARN của
B. anthracis và các chủng B. cereus gây nôn là khá giống nhau [15]. Như vậy, Các nghiên cứu đã cho thấy việc sử dụng trình tự 16S rARN không thích hợp để phân biệt B. cereus với các loài khác trong nhóm B. cereus [58].
Dựa trên gen gyrB
Yamamoto và Harayama đã gợi ý sử dụng gen gyrB thay thế cho 16S rARN làm một marker phân loại phân tử cho các loài vi khuẩn trong nhóm
Bacillus cereus. Gen gyrB mã hóa tiểu phần protein B của ADN gyrase (topoisomerase type II), gen này điều khiển sự siêu xoắn của 2 sợi ADN. Gen này có vai trò quan trọng trong quá trình nhân bản của ADN. Do vậy, người ta đã tách dòng và giải trình tự gen gyrB có kích thước 1,2 Kb của 4 loài trong nhóm Bacillus cereus (B. cereus, B. antharcis, B. thuringiensis, B. myco¿des).
Trên cơ sở đó, người ta đã thiết kế ra các cặp mồi dựa trên các đoạn đặc hiệu trong gen gyrB ở các loài trên và cặp mồi BC1 và BC2r đã được sử dụng để khuếch đại đoạn có kích thước 365bp của gen gyrB của B. cereus. Cặp mồi này có thể được sử dụng để nhận dạng B. cereus, nó mang tính đặc hiệu loài chứ không liên quan đến các nhân tố độc của chúng. Tuy nhiên đó cũng chưa phải là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định nhanh, chính xác bởi nó chỉ có vai trò trong việc phân biệt B. cereus và các loài còn lại trong nhóm mà đặc biệt là B. thuringiensis 58].
Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam các nhà khoa học đã và đang sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để tìm ra phương pháp xác định Bacillus cereus trong thực phẩm nhanh và chính xác.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu.
2.1.1. Sinh phẩm.
- 15 mẫu thực phẩm và thức ăn thừa thu thập tại một số quán ăn vỉa hè tại Hà Nội,
- Các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại gen độc tố gây độc và độc tố nôn trong bảng 2.1.
Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi khuếch đại gen cry2A
Tên mồi Tên
gen Trình tự thƣớc(bp)Kích
NheB
nhe
Cgg TTC ATC TgT TgC gAC AgC
1437
NheC CgA CTT CTg CTT gTg CTC CTg
HBL1
hblA
gTg CAg Atg TTg Atg CCg AT
319
HBL2 Atg CCA CTg CgT ggA CAT AT
BCET1
bceT
CgT AT Cgg TCg TTC ACT Cgg
663
BCET2 gTT gAT TTT CCg TAg CCT ggg
NRPS1
nrps
ggT TgA CAC ATT ATC ATA TAA ggT g
1271
NRPS2 gTA AgC gAA CCT gTC TgT AAC
AAC A
- Vector tách dòng pGEM do phòng Di truyền Vi sinh vật cung cấp
- Enzyme: enzyme giới hạn EcoRI, enzyme nối T4 - ligase, Taq- polymeraza…
2.1.2. Hóa chất và thiết bị.
2.1.2.1. Hóa chất.
- Hóa chất dùng cho phân lập và nuôi cấy: Cao thịt, Pepton, Trypton, cao men, agar…
- Hóa chất dùng nhuộm bào tử và tinh thể: fushin axit, fushin bazơ. - Hóa chất sử dụng trong điện di: agarose, SDS, Tris- base, TAE… - Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR: dNTPs, Buffer, Nước khử ion…
2.1.2.2. Thiết bị.
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc phòng Di truyền Vi sinh vật và phòng máy chung về công nghệ gen Viện Công nghệ Sinh học, gồm có:
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu.
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Máy chạy PCR Bộ điện di DNA Máy soi gel Máy chụp ảnh gen Máy li tâm Kính hiển vi quang học Máy Vortex Cân phân tích Cân điện tử Pipet man các loại Lò vi sóng Tủ lạnh -20o C Tủ ấm 28o C PTC- 100, Mỹ Thụy Điển Vilber Lourmat, Đức Gen Doc pharmacia Eppendof, Đức Olympus, Nhật Rotolab, OSI, Pháp Mettelex Toledo Ohaus
Sanyo, Nhật hoặc Gilson, Pháp Electrolux, Nhật
Frigor, Đan Mạch Friocell, Đức
2.1.2.3. Môi trường và dung dịch.
*/ Môi trường: Trong quá trình thí nghiệm có sử dụng các loại môi trường: - Môi trường phân lập và giữ chủng MPA
Cao thịt : 4 g NaCl : 5 g Peptone : 10 g H2O : 1 lít Agar : 16 g pH : 7 - 7,2 - Môi trường lỏng MPB
Cao thịt : 4 g NaCl : 5 g Peptone : 10 g H2O : 1 lít pH : 7 - 7,2
- Môi trường Craige dùng phân lập chủng có khả năng chuyển động: Cao thịt: 4 g NaCl: 5 g Peptone: 10 g H2O : 1 lít Bacto agar: 8 g pH : 7 - 7,2 - Môi trường LB:
Yeast extract : 5 g H2O : 1 lít NaCl : 5 g pH : 7 - 7,2 Trypton : 10 g
*/ Dung dịch tách chiết DNA plasmid:
- Dung dịch Sol I:
Tris - HCl 1M; pH=8 2,0 ml EDTA 0,5M; pH8 1,6 ml Glucose 0,72 g H2O khử ion tới 80 ml - Dung dịch Sol II:
NaOH 3M 100 µl SDS 10% 150 µl H2O khử ion 1250 µl
- Dung dịch Sol III:
CH3COOK 3M 23,52 g CH3COOH 9,2 ml - RNAse 10 mg/ ml :
Tris (0,1M; pH 7,5) 0,15 ml NaOH 1M 0,022 ml H2O khử ion 1,328 ml
*/ Dung dịch dùng trong phản ứng PCR và điện di agarose
- Dung dịch TAE 50X:
Tris base 121 g EDTA 0,5M; PH8 50 µl CH3COOH 28,6 µl H2O khử ion tới 50 ml - Dung dịch TAE 1X:
Dung dịch TAE 50X 10 ml Nước cất 490 ml - Loading Dye
Bromophenol Blue 1% 1 ml Glycerol 87% 3,45 ml H2O khử ion 5,55 ml
- EDTA (0,5 M; pH 8) H2O khử ion 100 ml EDTA 14,61 g Chỉnh pH bằng NaOH
*/ Dung dịch thuốc nhuộm
- Thuốc nhuộm bào tử (fushin axit) Fushin axit 1 g
H2O cất 100ml - Thuốc nhuộm tinh thể (fushin bazơ)
Fushin bazơ 0,1 g Etanol 95 % 10 ml Phenol 3 % 90 ml
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.2.1. Phương pháp phân lập
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn.
- Cấy khuẩn lạc vi khuẩn vào 2 ml môi trường LB, lắc qua đêm 200vòng/phút ở 37o
C.
- Hút 1,5 ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 6000 vòng/phút (4oC, 10phút).
- Loại dịch nổi thu cặn, bổ sung 150 μl dung dịch Sol I, vortex làm tan tủa. - Bổ sung 150 μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút)
- Bổ sung 150 μl dung dịch Sol III, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút)
- Ly tâm 12000 vòng/phút, thu dịch nổi, bổ sung 1 ml cồn tuyệt đối , ủ - 20oC (3giờ ).
- Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu cặn, làm khô tự nhiên - Bổ sung 30- 40 µl Rnase, ủ ở 37oC trong 1 giờ, bảo quản ở -200
C.
2.2.3. Phương pháp tách DNA tổng số
- Lấy khuẩn lạc vi khuẩn cấy vào 2 ml môi trường LB, lắc qua đêm 200 vòng/ phút ở 370
C .
- Ly tâm 6000 vòng/ phút trong 10 phút, thu tế bào, rửa lại bằng 100 μl H2O. - Bổ sung 30 μl SDS 10 %, mix nhẹ (votex).
- Bổ sung 6 μl proteaza K, ủ 370C trong 1 giờ. - Bổ sung 180 μl NaCl 5M, mix nhẹ bằng tay.
- Đẩy nước tới 500 μl.
- Bổ sung chloroform tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C.
- Thu dịch nổi (3 pha: pha trên cùng chứa DNA, xác tế bào. Dung môi). - Bổ sung chloroform/ phenol tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung choloroform với tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm thu dịch nổi.
- Bổ sung NaCOAC/ KOAC ( CH3COOK) tỷ lệ 1: 10. - Bổ sung ethanol 100 % (2.5:1) hoặc đẩy đến 1.5 ml. - Tủa ở -200C, 4 giờ hoặc qua đêm.
- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút, thu cặn. - Rửa bằng cồn 700C (300 μl).
- Ly tâm thu cặn ở 15000 vòng/ phút trong 10 phút. - Làm khô.
- Bổ sung 10 μl TE Rnase. - Ủ 370C trong 1 giờ. - Giữ ở 40 C.
2.2.4. Phương pháp tinh sạch plasmid của E. coli.
- Đẩy nước trong ống eppendorf có chứa DNA plasmid tách từ vi khuẩn lên 500 µl.
- Bổ sung chloroform : Isoamyl alcohol (24:1). Tỷ lệ bổ sung là 1:1, đảo nhẹ. - Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 1/10 NaOAC hoặc KOAC (1NaOAC/10 dịch nổi).
- Đẩy lên 1,5 ml bằng cồn tuyệt đối, ủ ở -20oC trong 4giờ hoặc qua đêm. - Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu tủa.
- Rửa bằng 300 µl cồn 70oC, ly tâm 12000 vòng/phút. Thu cặn, làm khô tự nhiên.
- Bổ sung 45 µl dH2O làm tan tủa, bảo quản ở -20o
2.2.5. Phương pháp PCR khuếch đại gen.
*/ Thành phần phản ứng PCR cho một chủng một cặp mồi với tổng thể tích20µl là: dNTPs : 2 µl Buffer : 2 µl Primer F : 1 µl Primer R : 1 µl Taq : 0,3 µl DNA : 2 µl Nước khử ion : 11,7 µl
2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose.
Nguyên tắc: Đây là phương pháp sử dụng để phân tích định tính cũng như định lượng của acid nucleic. Phương pháp điện di dựa vào cấu trúc của acid nucleic. Acid nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, khi nó ở trong điện trường nó sẽ chịu tác động của lực hút điện trường và di chuyển về phía cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử này phụ thuộc vào hai chỉ tiêu là trọng lượng phân tử của acid và nồng độ các chất cấu thành gel.
2.2.7. Phương pháp tách dòng gen nhe, hblA, bcet.
2.2.7.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM.
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối T4 - DNA ligase. Tùy vào nồng độ và chiều dài của đoạn gen cần nối mà có tỉ lệ trộn mẫu plasmid và đoạn gen nối (Sản phẩm PCR) khác nhau. Quá trình nối ghép được thực hiện trong điều kiện 4 - 6oC để tạo vector tái tổ hợp.
Thành phần phản ứng:
2X ligation buffer: 5 µl Vector: 1 µl
2.2.7.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α. */ Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α vào môi trường LB , nuôi lắc qua đêm ở 37o
C.
- Cấy chuyển 10% vào bình tam giác chứa 30 ml môi trường LB, nuôi lắc ở 37o
C trong 1,5 - 2 giờ.
- Ủ đá (4oC trong 1 giờ hoặc 45 phút), thỉnh thoảng đảo nhẹ.
- Hút vào ống eppendorf 1,5 trong điều kiện vô trùng (hút trong box) - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch.
- Rửa bằng 1 ml CaCl2 0,1M, voltex đều.
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch.
- Bổ sung 1 ml CaCl2 0,1M, voltex đều rồi ủ đá 2 giờ (15 phút đảo 1 lần). - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút (thu tế bào).
- Bổ sung 1 - 1,5 ml CaCl2 0,1M, voltex nhẹ, ủ đá 1 giờ (15 phút đảo 1 lần). - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu tế bào.
- Bổ sung 60 µl
- Hút 5 µl sản phẩm của phản ứng nối ghép gen vào dịch tế bào khả biến. - Ủ đá 30 phút (tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều).
- Sốc nhiệt 42oC trong 60 - 90 giây. Chuyển vào đá 2 phút.
- Bổ sung 200 - 300 µl môi trường LB, lắc ở 37oC trong 1 - 1,5 giờ. - Trang 100 µl vào đĩa peptri chứa môi trường LBA có bổ sung kháng sinh Ampicillin và X-gal. Nuôi ở 37oC từ 14 - 16 giờ.
2.2.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng.
Tiến hành xác định trình tự theo phương pháp của Sanger và cộng sự, dựa vào sự tổng hợp các mạch bổ sung cho mạch đơn DNA cần xác định. Dưới sự xúc tác của enzyme DNA - polymerase.
thường, nó còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) đã được đánh dấu bằng huỳnh quang. Đây là những dideoxynucleotide có nhóm -OH ở đầu 3’ được thay bằng -H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các đầu nối phosphodieste và do đó làm ngừng quá trình tổng hợp.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide có bổ sung ure để làm tăng độ phân giải của gen. Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotid