*/ Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM:
Ba chủng được sử dụng để tách dòng là HN1.1, HN7.9 và HN19.4. Sản phẩm PCR gen bceT, nhe và hblA của chúng được gắn trực tiếp vào vector pGEM bằng enzyme T4 - ligaza ở 4oC ta ̣o vector tái tổ hợp.
*/ Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α:
Tiến hành biến nạp hai vector tái tổ hợp trên vào tế bào E. coli chủng DH5α theo phương pháp sốc nhiê ̣t và cấy trải trên môi trường LBA có bổ sung Ampicillin và X -gal ở 37o
C. Sau 14 - 16 giờ thấy xuất hiê ̣n các khuẩn lạc xanh và trắng xen kẽ nhau . Những khuẩn la ̣c màu trắng là những khuẩn lạc có khả năng mang gen bceT, nhe và hblA(Hình 3.3).
Hình 3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi Khuẩn E.coli DH5α
Cấy các khuẩn la ̣c trắng vào môi trường LB lỏng để tách DNA plasmid. Tiến hành tách DNA plasmid và kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng điện di trên gel agarose 1%.
Để biết được plasmid tái tổ hợp có mang gen mong muốn hay không, chúng tôi lựa cho ̣n mô ̣t số dòng plasmid kiểm tra sự có mă ̣t của gen bceT, nhe và hblA bằng phương pháp cắt bằng enzyme giới ha ̣n
EcoRI và phương pháp PCR .
*/ Kiểm tra sự có mặt của gen bceT, nhe và hblA trong các dòng plasmid tái tổ hợp:
Do trên vector tách dòng pGEM có chứa vị trí cắt của enzyme EcoRI tiếp giáp với vùng đa cắt nối (vùng này cho phép cài gắn các đoạn gen cần tách dòng) nên chúng tôi sử dụng enzyme EcoRI để kiểm tra và đảm bảo quá trình tách dòng đã thực hiện thành công với vector tái tổ hợp. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.4. Điê ̣n di sản phẩm cắt DNA plasmid các dòng khuẩn la ̣c trắng trên gel 1% agarose
A: Các dòng pGEM-Teasy-bceT, B: Các dòng pGEM-Teasy-nhe, C: Các dòng pGEM-Teasy-hblA
DNA plasmid của các dòng khuẩn la ̣c trắng sau khi cắt bằng enzyme giới ha ̣n EcoRI ta ̣o ra 2 băng, băng vector tách dòng pGEM có kích thước khoảng hơn 3,9 kb, băng có kích thước của các gen độc tố bceT (0,7 bp), nhe
(1.4 kb) và hblA (319 bp) tương ứng với sản phẩm PCR của gen . Điều đó chứng tỏ đoạn gen đã gắn vào vector tách dòng pGEM thành công.
kb 0.7 0.5 1.5 3.0 kb 1 2 3 0.7 1.4 1 2 3 4 3.0 kb 0.3 0.3 3.0 0.5 kb 1 2 3 4 C B kb A B
Để có thể kết luận chính xác hơn về plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen bceT, nhe và hblA hay không chúng tôi tiến hành chạy PCR với khuôn DNA là các plasmid tái tổ hợp trên sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen bceT,
nhe và hblA.
*/ Kiểm tra sự có mặt của gen bceT, nhe và hblA trong vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR:
Phản ứng PCR kiểm tra được thực hiện sử dụng DNA plasmid tái tổ hợp làm khuôn và cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện qua hình 3.5.
Kết quả thu được chỉ có 1 băng duy nhất với kích thước của các gen
độc tố bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) và hblA (319 bp) giống với sản phẩm PCR với DNA được tách từ chủng HN1.1, HN7.9 và HN19.4 .
Từ những kết quả thu được ở trên, bước đầu chúng tôi có thể kết luận là đã tách dòng thành công gen bceT, nhe và hblA của 3 chủng HN1.1, HN7.9 và HN19.4 trong vector pGEM. Tuy nhiên, để kiểm tra chính xác gen tách dòng là gen bceT, nhe và hblA hay không, chúng tôi tiến hành đọc trình tự đoạn gen này và so sánh với các trình tự gen đã đăng ký trong Ngân hàng Gen Quốc tế bằng phần mềm chuyên dụng.
Hình 3.5 . Điê ̣n di sản phẩm PCR của các dòng khuẩn lạc trắng trên
gel 1% agarose
1-3: Các dòng pGEM-Teasy-bceT
5-8: Các dòng pGEM-Teasy-hblA
9,10: Các dòng pGEM-Teasy-nhe
4,11: Thang DNA chuẩn (Fermentas)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1.7˜ 0.9˜ 0.6˜ kb 1.5 0.7 0.5 kb