2.1.2.1. Hóa chất.
- Hóa chất dùng cho phân lập và nuôi cấy: Cao thịt, Pepton, Trypton, cao men, agar…
- Hóa chất dùng nhuộm bào tử và tinh thể: fushin axit, fushin bazơ. - Hóa chất sử dụng trong điện di: agarose, SDS, Tris- base, TAE… - Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR: dNTPs, Buffer, Nước khử ion…
2.1.2.2. Thiết bị.
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc phòng Di truyền Vi sinh vật và phòng máy chung về công nghệ gen Viện Công nghệ Sinh học, gồm có:
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu.
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Máy chạy PCR Bộ điện di DNA Máy soi gel Máy chụp ảnh gen Máy li tâm Kính hiển vi quang học Máy Vortex Cân phân tích Cân điện tử Pipet man các loại Lò vi sóng Tủ lạnh -20o C Tủ ấm 28o C PTC- 100, Mỹ Thụy Điển Vilber Lourmat, Đức Gen Doc pharmacia Eppendof, Đức Olympus, Nhật Rotolab, OSI, Pháp Mettelex Toledo Ohaus
Sanyo, Nhật hoặc Gilson, Pháp Electrolux, Nhật
Frigor, Đan Mạch Friocell, Đức
2.1.2.3. Môi trường và dung dịch.
*/ Môi trường: Trong quá trình thí nghiệm có sử dụng các loại môi trường: - Môi trường phân lập và giữ chủng MPA
Cao thịt : 4 g NaCl : 5 g Peptone : 10 g H2O : 1 lít Agar : 16 g pH : 7 - 7,2 - Môi trường lỏng MPB
Cao thịt : 4 g NaCl : 5 g Peptone : 10 g H2O : 1 lít pH : 7 - 7,2
- Môi trường Craige dùng phân lập chủng có khả năng chuyển động: Cao thịt: 4 g NaCl: 5 g Peptone: 10 g H2O : 1 lít Bacto agar: 8 g pH : 7 - 7,2 - Môi trường LB:
Yeast extract : 5 g H2O : 1 lít NaCl : 5 g pH : 7 - 7,2 Trypton : 10 g
*/ Dung dịch tách chiết DNA plasmid:
- Dung dịch Sol I:
Tris - HCl 1M; pH=8 2,0 ml EDTA 0,5M; pH8 1,6 ml Glucose 0,72 g H2O khử ion tới 80 ml - Dung dịch Sol II:
NaOH 3M 100 µl SDS 10% 150 µl H2O khử ion 1250 µl
- Dung dịch Sol III:
CH3COOK 3M 23,52 g CH3COOH 9,2 ml - RNAse 10 mg/ ml :
Tris (0,1M; pH 7,5) 0,15 ml NaOH 1M 0,022 ml H2O khử ion 1,328 ml
*/ Dung dịch dùng trong phản ứng PCR và điện di agarose
- Dung dịch TAE 50X:
Tris base 121 g EDTA 0,5M; PH8 50 µl CH3COOH 28,6 µl H2O khử ion tới 50 ml - Dung dịch TAE 1X:
Dung dịch TAE 50X 10 ml Nước cất 490 ml - Loading Dye
Bromophenol Blue 1% 1 ml Glycerol 87% 3,45 ml H2O khử ion 5,55 ml
- EDTA (0,5 M; pH 8) H2O khử ion 100 ml EDTA 14,61 g Chỉnh pH bằng NaOH
*/ Dung dịch thuốc nhuộm
- Thuốc nhuộm bào tử (fushin axit) Fushin axit 1 g
H2O cất 100ml - Thuốc nhuộm tinh thể (fushin bazơ)
Fushin bazơ 0,1 g Etanol 95 % 10 ml Phenol 3 % 90 ml
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.2.1. Phương pháp phân lập
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn.
- Cấy khuẩn lạc vi khuẩn vào 2 ml môi trường LB, lắc qua đêm 200vòng/phút ở 37o
C.
- Hút 1,5 ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 6000 vòng/phút (4oC, 10phút).
- Loại dịch nổi thu cặn, bổ sung 150 μl dung dịch Sol I, vortex làm tan tủa. - Bổ sung 150 μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút)
- Bổ sung 150 μl dung dịch Sol III, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút)
- Ly tâm 12000 vòng/phút, thu dịch nổi, bổ sung 1 ml cồn tuyệt đối , ủ - 20oC (3giờ ).
- Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu cặn, làm khô tự nhiên - Bổ sung 30- 40 µl Rnase, ủ ở 37oC trong 1 giờ, bảo quản ở -200
C.
2.2.3. Phương pháp tách DNA tổng số
- Lấy khuẩn lạc vi khuẩn cấy vào 2 ml môi trường LB, lắc qua đêm 200 vòng/ phút ở 370
C .
- Ly tâm 6000 vòng/ phút trong 10 phút, thu tế bào, rửa lại bằng 100 μl H2O. - Bổ sung 30 μl SDS 10 %, mix nhẹ (votex).
- Bổ sung 6 μl proteaza K, ủ 370C trong 1 giờ. - Bổ sung 180 μl NaCl 5M, mix nhẹ bằng tay.
- Đẩy nước tới 500 μl.
- Bổ sung chloroform tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C.
- Thu dịch nổi (3 pha: pha trên cùng chứa DNA, xác tế bào. Dung môi). - Bổ sung chloroform/ phenol tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung choloroform với tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm thu dịch nổi.
- Bổ sung NaCOAC/ KOAC ( CH3COOK) tỷ lệ 1: 10. - Bổ sung ethanol 100 % (2.5:1) hoặc đẩy đến 1.5 ml. - Tủa ở -200C, 4 giờ hoặc qua đêm.
- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút, thu cặn. - Rửa bằng cồn 700C (300 μl).
- Ly tâm thu cặn ở 15000 vòng/ phút trong 10 phút. - Làm khô.
- Bổ sung 10 μl TE Rnase. - Ủ 370C trong 1 giờ. - Giữ ở 40 C.
2.2.4. Phương pháp tinh sạch plasmid của E. coli.
- Đẩy nước trong ống eppendorf có chứa DNA plasmid tách từ vi khuẩn lên 500 µl.
- Bổ sung chloroform : Isoamyl alcohol (24:1). Tỷ lệ bổ sung là 1:1, đảo nhẹ. - Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 1/10 NaOAC hoặc KOAC (1NaOAC/10 dịch nổi).
- Đẩy lên 1,5 ml bằng cồn tuyệt đối, ủ ở -20oC trong 4giờ hoặc qua đêm. - Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu tủa.
- Rửa bằng 300 µl cồn 70oC, ly tâm 12000 vòng/phút. Thu cặn, làm khô tự nhiên.
- Bổ sung 45 µl dH2O làm tan tủa, bảo quản ở -20o
2.2.5. Phương pháp PCR khuếch đại gen.
*/ Thành phần phản ứng PCR cho một chủng một cặp mồi với tổng thể tích20µl là: dNTPs : 2 µl Buffer : 2 µl Primer F : 1 µl Primer R : 1 µl Taq : 0,3 µl DNA : 2 µl Nước khử ion : 11,7 µl
2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose.
Nguyên tắc: Đây là phương pháp sử dụng để phân tích định tính cũng như định lượng của acid nucleic. Phương pháp điện di dựa vào cấu trúc của acid nucleic. Acid nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, khi nó ở trong điện trường nó sẽ chịu tác động của lực hút điện trường và di chuyển về phía cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử này phụ thuộc vào hai chỉ tiêu là trọng lượng phân tử của acid và nồng độ các chất cấu thành gel.
2.2.7. Phương pháp tách dòng gen nhe, hblA, bcet.
2.2.7.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM.
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối T4 - DNA ligase. Tùy vào nồng độ và chiều dài của đoạn gen cần nối mà có tỉ lệ trộn mẫu plasmid và đoạn gen nối (Sản phẩm PCR) khác nhau. Quá trình nối ghép được thực hiện trong điều kiện 4 - 6oC để tạo vector tái tổ hợp.
Thành phần phản ứng:
2X ligation buffer: 5 µl Vector: 1 µl
2.2.7.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α. */ Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α vào môi trường LB , nuôi lắc qua đêm ở 37o
C.
- Cấy chuyển 10% vào bình tam giác chứa 30 ml môi trường LB, nuôi lắc ở 37o
C trong 1,5 - 2 giờ.
- Ủ đá (4oC trong 1 giờ hoặc 45 phút), thỉnh thoảng đảo nhẹ.
- Hút vào ống eppendorf 1,5 trong điều kiện vô trùng (hút trong box) - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch.
- Rửa bằng 1 ml CaCl2 0,1M, voltex đều.
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch.
- Bổ sung 1 ml CaCl2 0,1M, voltex đều rồi ủ đá 2 giờ (15 phút đảo 1 lần). - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút (thu tế bào).
- Bổ sung 1 - 1,5 ml CaCl2 0,1M, voltex nhẹ, ủ đá 1 giờ (15 phút đảo 1 lần). - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu tế bào.
- Bổ sung 60 µl
- Hút 5 µl sản phẩm của phản ứng nối ghép gen vào dịch tế bào khả biến. - Ủ đá 30 phút (tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều).
- Sốc nhiệt 42oC trong 60 - 90 giây. Chuyển vào đá 2 phút.
- Bổ sung 200 - 300 µl môi trường LB, lắc ở 37oC trong 1 - 1,5 giờ. - Trang 100 µl vào đĩa peptri chứa môi trường LBA có bổ sung kháng sinh Ampicillin và X-gal. Nuôi ở 37oC từ 14 - 16 giờ.
2.2.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng.
Tiến hành xác định trình tự theo phương pháp của Sanger và cộng sự, dựa vào sự tổng hợp các mạch bổ sung cho mạch đơn DNA cần xác định. Dưới sự xúc tác của enzyme DNA - polymerase.
thường, nó còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) đã được đánh dấu bằng huỳnh quang. Đây là những dideoxynucleotide có nhóm -OH ở đầu 3’ được thay bằng -H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các đầu nối phosphodieste và do đó làm ngừng quá trình tổng hợp.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide có bổ sung ure để làm tăng độ phân giải của gen. Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotid đánh dấu.
Xử lý kết quả bằng phần mềm PC/GENE, sau đó tiến hành so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập Bacillus cereus trên môi trƣờng MYP
Từ những mẫu cơm, gạo, thức ăn thừa thu thập tại một số quan ăn vỉa hè tại Hà Nội, tiến hành làm giàu mẫu trong 14 giờ, sau đó, pha loãng tới 10-6
, 10-7 và cấy trải 100µl lên môi trường chọn lọc MYP để chọn ra những khuẩn lạc đặc trưng. Môi trường MYP được sử dụng làm môi trường chọn lọc dựa vào các đặc điểm như phản ứng sinh lecithinase, khả năng không sử dụng manitol làm nguồn các bon như là đặc tính xác định và khả năng kháng polymyxin như là đặc tính chọn lọc. Các khuẩn lạc của vi khuẩn B.cereus có màu hồng eosin do các chủng không có khả năng sử dụng manitol, xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng do có khả năng sinh enzim lecithinase (Hình 3.1).
Nghiên cứu đă ̣c tính đă ̣c tính sinh lý, sinh hóa của các chủng thu nhâ ̣n được, kết quả cho thấy có 43 chủng có đặc tính giống với chủng B. cereus chuẩn.
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc B. cereus trên môi trƣờ ng MYP sau 12 giờ nuôi 3.2. Phát hiện gen mã hóa độc tố của Bacillus cereus bằng phả n ƣ́ng PCR
Các chủng vi khuẩn có đặc điểm giống với chủng chuẩn của Bacillus cereus được tiến hành nuôi cấy trên môi trưởng MPB qua đêm và tiến hành tách chiết DNA plasmid theo phương pháp đã nêu trong mục 2.2.3 phần vật liệu và phương pháp . Tiến hành phản ứng PCR với các că ̣p mồi đă ̣c hiê ̣u nhằm khuếch đa ̣i các gen nhe, hblA, bcet với chu trình nhiê ̣t thích hợp . Sản phẩm PCR được điê ̣n di trên gel 1% agarose. Kết quả được thể hiện trong hình 3.2.
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại các gen độc tố của gen
bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) và hblA (319 bp)
A: 1,2,3: Sản phẩm điện di gen bceT các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ thực phẩm vỉa hè: HN1.1, HN7.9, HN11.5, HN17.3, HN19.4
4.thang chuẩn DNA
B. 1,2,3,5,6,7,8: Sản phẩm điện di gen nhe các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ thực phẩm vỉa hè:HN1.1, HN3.3, HN3.7, HN7.8, HN7.9, HN11.5, HN17.3
C. 1,2,35,6,7,8: Sản phẩm điện di gen hblA các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ thực phẩm vỉa hè: HN1.1, HN3.3, HN3.7, HN7.8, HN7.9, HN11.5, HN17.3
Trong tổng số 43 chủng nghi ngờ là B. cereus, có 3 chủng (6,9%) mang gen bcet, 20 chủng (46,5%) mang gen nhe và 17 chủng (39,5%) mang gen
hblA. Trong đó , có 3 chủng HN1.1, HN7.9, HN11.5 mang 2 gen nhe, bceT; 1 chủng HN19.4 mang 2 gen bceT và hblA; còn lại là các chủng mang 1 trong 3 gen. 21 chủng không mang bất cứ u gen nào . Tuy nhiên, có thể các chủng này sẽ mang các gen khác trong 2 operon NHE và HBL . Không có chủng nào mang gen mã hóa đô ̣c tố cereulide từ các chủng nghiên cứu . Để xác định các đoạn gen trên có đúng là các gen độc tố của gen bceT, nhe và hblA hay không chúng tôi lựa chọn 3 chủng HN1.1, HN7.9 và HN19.4 để tách dòng và đọc trình tự gen xác định gem trên ngân hàng gen quốc tế.
1.5 1,0 Kb 1 2 3 4 5 6 7 8 0.5 0.3 Kb 1.0 0.7 Kb 0.5
3.3. Tách dòng và đọc trình tự gen bceT, nhe và hblA.
3.3.1. Tách dòng gen bceT, nhe và hblA.
*/ Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM:
Ba chủng được sử dụng để tách dòng là HN1.1, HN7.9 và HN19.4. Sản phẩm PCR gen bceT, nhe và hblA của chúng được gắn trực tiếp vào vector pGEM bằng enzyme T4 - ligaza ở 4oC ta ̣o vector tái tổ hợp.
*/ Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α:
Tiến hành biến nạp hai vector tái tổ hợp trên vào tế bào E. coli chủng DH5α theo phương pháp sốc nhiê ̣t và cấy trải trên môi trường LBA có bổ sung Ampicillin và X -gal ở 37o
C. Sau 14 - 16 giờ thấy xuất hiê ̣n các khuẩn lạc xanh và trắng xen kẽ nhau . Những khuẩn la ̣c màu trắng là những khuẩn lạc có khả năng mang gen bceT, nhe và hblA(Hình 3.3).
Hình 3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi Khuẩn E.coli DH5α
Cấy các khuẩn la ̣c trắng vào môi trường LB lỏng để tách DNA plasmid. Tiến hành tách DNA plasmid và kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng điện di trên gel agarose 1%.
Để biết được plasmid tái tổ hợp có mang gen mong muốn hay không, chúng tôi lựa cho ̣n mô ̣t số dòng plasmid kiểm tra sự có mă ̣t của gen bceT, nhe và hblA bằng phương pháp cắt bằng enzyme giới ha ̣n
EcoRI và phương pháp PCR .
*/ Kiểm tra sự có mặt của gen bceT, nhe và hblA trong các dòng plasmid tái tổ hợp:
Do trên vector tách dòng pGEM có chứa vị trí cắt của enzyme EcoRI tiếp giáp với vùng đa cắt nối (vùng này cho phép cài gắn các đoạn gen cần tách dòng) nên chúng tôi sử dụng enzyme EcoRI để kiểm tra và đảm bảo quá trình tách dòng đã thực hiện thành công với vector tái tổ hợp. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.4. Điê ̣n di sản phẩm cắt DNA plasmid các dòng khuẩn la ̣c trắng trên gel 1% agarose
A: Các dòng pGEM-Teasy-bceT, B: Các dòng pGEM-Teasy-nhe, C: Các dòng pGEM-Teasy-hblA
DNA plasmid của các dòng khuẩn la ̣c trắng sau khi cắt bằng enzyme giới ha ̣n EcoRI ta ̣o ra 2 băng, băng vector tách dòng pGEM có kích thước khoảng hơn 3,9 kb, băng có kích thước của các gen độc tố bceT (0,7 bp), nhe
(1.4 kb) và hblA (319 bp) tương ứng với sản phẩm PCR của gen . Điều đó chứng tỏ đoạn gen đã gắn vào vector tách dòng pGEM thành công.
kb 0.7 0.5 1.5 3.0 kb 1 2 3 0.7 1.4 1 2 3 4 3.0 kb 0.3 0.3 3.0 0.5 kb 1 2 3 4 C B kb A B
Để có thể kết luận chính xác hơn về plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen bceT, nhe và hblA hay không chúng tôi tiến hành chạy PCR với khuôn DNA là các plasmid tái tổ hợp trên sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen bceT,
nhe và hblA.
*/ Kiểm tra sự có mặt của gen bceT, nhe và hblA trong vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR:
Phản ứng PCR kiểm tra được thực hiện sử dụng DNA plasmid tái tổ hợp làm khuôn và cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện qua hình 3.5.