2.2.7.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM.
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối T4 - DNA ligase. Tùy vào nồng độ và chiều dài của đoạn gen cần nối mà có tỉ lệ trộn mẫu plasmid và đoạn gen nối (Sản phẩm PCR) khác nhau. Quá trình nối ghép được thực hiện trong điều kiện 4 - 6oC để tạo vector tái tổ hợp.
Thành phần phản ứng:
2X ligation buffer: 5 µl Vector: 1 µl
2.2.7.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α. */ Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α vào môi trường LB , nuôi lắc qua đêm ở 37o
C.
- Cấy chuyển 10% vào bình tam giác chứa 30 ml môi trường LB, nuôi lắc ở 37o
C trong 1,5 - 2 giờ.
- Ủ đá (4oC trong 1 giờ hoặc 45 phút), thỉnh thoảng đảo nhẹ.
- Hút vào ống eppendorf 1,5 trong điều kiện vô trùng (hút trong box) - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch.
- Rửa bằng 1 ml CaCl2 0,1M, voltex đều.
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch.
- Bổ sung 1 ml CaCl2 0,1M, voltex đều rồi ủ đá 2 giờ (15 phút đảo 1 lần). - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút (thu tế bào).
- Bổ sung 1 - 1,5 ml CaCl2 0,1M, voltex nhẹ, ủ đá 1 giờ (15 phút đảo 1 lần). - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu tế bào.
- Bổ sung 60 µl
- Hút 5 µl sản phẩm của phản ứng nối ghép gen vào dịch tế bào khả biến. - Ủ đá 30 phút (tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều).
- Sốc nhiệt 42oC trong 60 - 90 giây. Chuyển vào đá 2 phút.
- Bổ sung 200 - 300 µl môi trường LB, lắc ở 37oC trong 1 - 1,5 giờ. - Trang 100 µl vào đĩa peptri chứa môi trường LBA có bổ sung kháng sinh Ampicillin và X-gal. Nuôi ở 37oC từ 14 - 16 giờ.