Tiến hành xác định trình tự theo phương pháp của Sanger và cộng sự, dựa vào sự tổng hợp các mạch bổ sung cho mạch đơn DNA cần xác định. Dưới sự xúc tác của enzyme DNA - polymerase.
thường, nó còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) đã được đánh dấu bằng huỳnh quang. Đây là những dideoxynucleotide có nhóm -OH ở đầu 3’ được thay bằng -H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các đầu nối phosphodieste và do đó làm ngừng quá trình tổng hợp.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide có bổ sung ure để làm tăng độ phân giải của gen. Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotid đánh dấu.
Xử lý kết quả bằng phần mềm PC/GENE, sau đó tiến hành so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập Bacillus cereus trên môi trƣờng MYP
Từ những mẫu cơm, gạo, thức ăn thừa thu thập tại một số quan ăn vỉa hè tại Hà Nội, tiến hành làm giàu mẫu trong 14 giờ, sau đó, pha loãng tới 10-6
, 10-7 và cấy trải 100µl lên môi trường chọn lọc MYP để chọn ra những khuẩn lạc đặc trưng. Môi trường MYP được sử dụng làm môi trường chọn lọc dựa vào các đặc điểm như phản ứng sinh lecithinase, khả năng không sử dụng manitol làm nguồn các bon như là đặc tính xác định và khả năng kháng polymyxin như là đặc tính chọn lọc. Các khuẩn lạc của vi khuẩn B.cereus có màu hồng eosin do các chủng không có khả năng sử dụng manitol, xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng do có khả năng sinh enzim lecithinase (Hình 3.1).
Nghiên cứu đă ̣c tính đă ̣c tính sinh lý, sinh hóa của các chủng thu nhâ ̣n được, kết quả cho thấy có 43 chủng có đặc tính giống với chủng B. cereus chuẩn.
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc B. cereus trên môi trƣờ ng MYP sau 12 giờ nuôi 3.2. Phát hiện gen mã hóa độc tố của Bacillus cereus bằng phả n ƣ́ng PCR
Các chủng vi khuẩn có đặc điểm giống với chủng chuẩn của Bacillus cereus được tiến hành nuôi cấy trên môi trưởng MPB qua đêm và tiến hành tách chiết DNA plasmid theo phương pháp đã nêu trong mục 2.2.3 phần vật liệu và phương pháp . Tiến hành phản ứng PCR với các că ̣p mồi đă ̣c hiê ̣u nhằm khuếch đa ̣i các gen nhe, hblA, bcet với chu trình nhiê ̣t thích hợp . Sản phẩm PCR được điê ̣n di trên gel 1% agarose. Kết quả được thể hiện trong hình 3.2.
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại các gen độc tố của gen
bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) và hblA (319 bp)
A: 1,2,3: Sản phẩm điện di gen bceT các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ thực phẩm vỉa hè: HN1.1, HN7.9, HN11.5, HN17.3, HN19.4
4.thang chuẩn DNA
B. 1,2,3,5,6,7,8: Sản phẩm điện di gen nhe các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ thực phẩm vỉa hè:HN1.1, HN3.3, HN3.7, HN7.8, HN7.9, HN11.5, HN17.3
C. 1,2,35,6,7,8: Sản phẩm điện di gen hblA các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ thực phẩm vỉa hè: HN1.1, HN3.3, HN3.7, HN7.8, HN7.9, HN11.5, HN17.3
Trong tổng số 43 chủng nghi ngờ là B. cereus, có 3 chủng (6,9%) mang gen bcet, 20 chủng (46,5%) mang gen nhe và 17 chủng (39,5%) mang gen
hblA. Trong đó , có 3 chủng HN1.1, HN7.9, HN11.5 mang 2 gen nhe, bceT; 1 chủng HN19.4 mang 2 gen bceT và hblA; còn lại là các chủng mang 1 trong 3 gen. 21 chủng không mang bất cứ u gen nào . Tuy nhiên, có thể các chủng này sẽ mang các gen khác trong 2 operon NHE và HBL . Không có chủng nào mang gen mã hóa đô ̣c tố cereulide từ các chủng nghiên cứu . Để xác định các đoạn gen trên có đúng là các gen độc tố của gen bceT, nhe và hblA hay không chúng tôi lựa chọn 3 chủng HN1.1, HN7.9 và HN19.4 để tách dòng và đọc trình tự gen xác định gem trên ngân hàng gen quốc tế.
1.5 1,0 Kb 1 2 3 4 5 6 7 8 0.5 0.3 Kb 1.0 0.7 Kb 0.5
3.3. Tách dòng và đọc trình tự gen bceT, nhe và hblA.
3.3.1. Tách dòng gen bceT, nhe và hblA.
*/ Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM:
Ba chủng được sử dụng để tách dòng là HN1.1, HN7.9 và HN19.4. Sản phẩm PCR gen bceT, nhe và hblA của chúng được gắn trực tiếp vào vector pGEM bằng enzyme T4 - ligaza ở 4oC ta ̣o vector tái tổ hợp.
*/ Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α:
Tiến hành biến nạp hai vector tái tổ hợp trên vào tế bào E. coli chủng DH5α theo phương pháp sốc nhiê ̣t và cấy trải trên môi trường LBA có bổ sung Ampicillin và X -gal ở 37o
C. Sau 14 - 16 giờ thấy xuất hiê ̣n các khuẩn lạc xanh và trắng xen kẽ nhau . Những khuẩn la ̣c màu trắng là những khuẩn lạc có khả năng mang gen bceT, nhe và hblA(Hình 3.3).
Hình 3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi Khuẩn E.coli DH5α
Cấy các khuẩn la ̣c trắng vào môi trường LB lỏng để tách DNA plasmid. Tiến hành tách DNA plasmid và kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng điện di trên gel agarose 1%.
Để biết được plasmid tái tổ hợp có mang gen mong muốn hay không, chúng tôi lựa cho ̣n mô ̣t số dòng plasmid kiểm tra sự có mă ̣t của gen bceT, nhe và hblA bằng phương pháp cắt bằng enzyme giới ha ̣n
EcoRI và phương pháp PCR .
*/ Kiểm tra sự có mặt của gen bceT, nhe và hblA trong các dòng plasmid tái tổ hợp:
Do trên vector tách dòng pGEM có chứa vị trí cắt của enzyme EcoRI tiếp giáp với vùng đa cắt nối (vùng này cho phép cài gắn các đoạn gen cần tách dòng) nên chúng tôi sử dụng enzyme EcoRI để kiểm tra và đảm bảo quá trình tách dòng đã thực hiện thành công với vector tái tổ hợp. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.4. Điê ̣n di sản phẩm cắt DNA plasmid các dòng khuẩn la ̣c trắng trên gel 1% agarose
A: Các dòng pGEM-Teasy-bceT, B: Các dòng pGEM-Teasy-nhe, C: Các dòng pGEM-Teasy-hblA
DNA plasmid của các dòng khuẩn la ̣c trắng sau khi cắt bằng enzyme giới ha ̣n EcoRI ta ̣o ra 2 băng, băng vector tách dòng pGEM có kích thước khoảng hơn 3,9 kb, băng có kích thước của các gen độc tố bceT (0,7 bp), nhe
(1.4 kb) và hblA (319 bp) tương ứng với sản phẩm PCR của gen . Điều đó chứng tỏ đoạn gen đã gắn vào vector tách dòng pGEM thành công.
kb 0.7 0.5 1.5 3.0 kb 1 2 3 0.7 1.4 1 2 3 4 3.0 kb 0.3 0.3 3.0 0.5 kb 1 2 3 4 C B kb A B
Để có thể kết luận chính xác hơn về plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen bceT, nhe và hblA hay không chúng tôi tiến hành chạy PCR với khuôn DNA là các plasmid tái tổ hợp trên sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen bceT,
nhe và hblA.
*/ Kiểm tra sự có mặt của gen bceT, nhe và hblA trong vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR:
Phản ứng PCR kiểm tra được thực hiện sử dụng DNA plasmid tái tổ hợp làm khuôn và cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện qua hình 3.5.
Kết quả thu được chỉ có 1 băng duy nhất với kích thước của các gen
độc tố bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) và hblA (319 bp) giống với sản phẩm PCR với DNA được tách từ chủng HN1.1, HN7.9 và HN19.4 .
Từ những kết quả thu được ở trên, bước đầu chúng tôi có thể kết luận là đã tách dòng thành công gen bceT, nhe và hblA của 3 chủng HN1.1, HN7.9 và HN19.4 trong vector pGEM. Tuy nhiên, để kiểm tra chính xác gen tách dòng là gen bceT, nhe và hblA hay không, chúng tôi tiến hành đọc trình tự đoạn gen này và so sánh với các trình tự gen đã đăng ký trong Ngân hàng Gen Quốc tế bằng phần mềm chuyên dụng.
Hình 3.5 . Điê ̣n di sản phẩm PCR của các dòng khuẩn lạc trắng trên
gel 1% agarose
1-3: Các dòng pGEM-Teasy-bceT
5-8: Các dòng pGEM-Teasy-hblA
9,10: Các dòng pGEM-Teasy-nhe
4,11: Thang DNA chuẩn (Fermentas)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1.7˜ 0.9˜ 0.6˜ kb 1.5 0.7 0.5 kb
3.3.2. Đọc trình tự gen má hóa các độc tố
3.3.3.1. Gen mã hóa độc tố BCET
DNA plasmid của các dòng khuẩn la ̣c trắng được tinh sa ̣ch và đo ̣c trình tự . Trình tự nucleotid của gen bcet ở chủng HN1.1 có 10 vị trí thay đổi và HN7.9 có 13 vị trí thay đổi so với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen (Mã số D17312) và với độ tương đồng 98%. Sau khi di ̣ch mã trên lý thuyết , trình tự protein được so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen quốc tế . Kết quả cho thấy trình tự protein có 221 acid amin trong đó , HN1.1 có 3 vị trí thay đổi (163: Q thành R, 175: A thành T, 222: F thành I) (98%) còn HN7.9 có 3 vị trí thay đổi (52: A thành T, 175: A thành T, 222: F thành I) (98%) so với trình tự có mã số BAA04134.1 (hinh 3.6). 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| BAA04134.1 RIGRSLGIHLILATQKPSGVVDDQIWSNSKFKLALKVQNTSDSNEILKTPDAAEITLPGR HN1.1 RIGRSLGIHLILATQKPSGVVDDQIWSNSKFKLALKVQNTSDSNEILKTPDAAEITLPGR HN7.9 RIGRSLGIHLILATQKPSGVVDDQIWSNSKFKLALKVQNTSDSNEILKTPDTAEITLPGR 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| BAA04134.1 AYLQVGNNEIYELFQSAWSGADYVENKEDKEHLDATIYAINDLGQYEILSEDLSGLGSSK HN1.1 AYLQVGNNEIYELFQSAWSGADYVENKEDKEHLDATIYAINDLGQYEILSEDLSGLGSSK HN7.9 AYLQVGNNEIYELFQSAWSGADYVENKEDKEHLDATIYAINDLGQYEILSEDLSGLGSSK 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| BAA04134.1 EVISVPSELDAVIDYIHDYAEINEIEALARPWLPPLPESVYLQDLHAIQFKEAWAKEKKP HN1.1 EVISVPSELDAVIDYIHDYAEINEIEALARPWLPPLPESVYLRDLHAIQFKEAWTKEKKP HN7.9 EVISVPSELDAVIDYIHDYAEINEIEALARPWLPPLPESVYLQDLHAIQFKEAWTKEKKP 190 200 210 220 ....|....|....|....|....|....|....|....|.. BAA04134.1 LQATVGLLDQPELQSQTPLTLDISKDGHVAVFSSPGYGKSTF HN1.1 LQATIGLLDQPELQSQTPLTLDISKDGHVAVFSSPGYGKSTI HN7.9 LQATVGLLDQPELQSQTPLTLDISKDGHVAVFSSPGYGKSTI
Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid của protrein BCET vói trình tự BAA041341 trên ngân hàng gen quốc tế
3.3.3.2. Gen mã hóa độc tố NHE
DNA plasmid của các dòng khuẩn la ̣c trắng được tinh sa ̣ch và đo ̣c trình tự . Trình tự nucleotid của gen bcet ở chủng HN 7.9 có 51 vị trí thay đổi so với
trình tự đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế (Mã số DQ153257.1) và có độ tương đồng 93%. Trình tự đã dịch mã trên lý thuyết được so sánh với trình tự protein có mã số ACO 28519.1. Kết quả cho thấy HN 7.9 có đoạn gen được dịch mã có 278 acid amin với đô ̣ tương đồng 97%, trong đó có 7 vị trí thay đổi (28: T thành S , 71: N thành K , 133: T thành A ; 137: V thành S , 174: N thành D; 180: D thành N, 198: A thành S) (hình 3.7). 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACO28519.1 MQKRFYKKCLLTLMIAGVATSNAFPLHTFAAEQNVKVLQENAKDYSLGPAGFQDVMAQTT HN7.9 MQKRFYKKCLLTLMIAGVATSNAFPLHSFAAEQNVKVLQENAKDYSLGPAGFQDVMAQTT 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACO28519.1 SSIFAMDSYANLIQNQQETDLSKISSINSEFKGNMMQHQRDAKINAAYWLDRMKPQIMKT HN7.9 SSIFAMDSYAKLIQNQQETDLSKISSINSEFKGNMMQHQRDAKINAAYWLDRMKPQIMKT 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACO28519.1 DQNIINYNNTFQTYYNVMLIAIDQKDSVKLKADLEKLYADIVKNQNEVDVLLGNLKAFRD HN7.9 DQNIINYNNTFQAYYNSMLIAIDQKDSVKLKADLEKLYADIVKNQNEVDVLLGDLKAFRN 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ACO28519.1 RMAKDTNSFKEDTNQLTAILASTNAGIPALEQQINTYNDSIKKSNDMVIAGGVLCVALIT
HN7.9 RMAKDTNSFKEDTNQLTSILASTNAGIPALEQQINTYNDSIKKSNDMVIAGGVLCVALIT
250 260 270 ....|....|....|....|....|....|....|...
ACO28519.1 CLAGGPMIAVAKKDIANAEREIANLKDRISGAQAEVAI
HN7.9 CLAGGPMIAVAKKDIANAEREIANLKDRISGAQAEVAI
Hình 3.7. So sánh trình tự amino acid của protrein NHE vói trình tự DQ153257.1 trên ngân hàng gen quốc tế
3.3.3.3. Gen mã hóa độc tố HBL
Trình tự nucleotid gen HBL của chủng HN 1.1 và HN19.4 cho thấy có 3 vị trí biến đổi với độ tương đồng 99% so với trình tự mang mã số L20441.1 trên ngân hàng gen quốc tế . Tuy nhiên 3 nucleotid biến đổi này không ảnh hưởng đến sự dịch mã tạo acid amin . Trình tự acid amin sau dịch mã có 106 acid amin với đô ̣ tương đồng 100% so với trình tự EEK50059.1 (hình 3.8).
10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EEK50059.1 ADVDADQKRLEEVLGSVNYYKQLESDGFNVMKGAILGLPIIGGIIVGVARDNLGKLEPLL
HN1.1 ADVDADQKRLEEVLGSVNYYKQLESDGFNVMKGAILGLPIIGGIIVGVARDNLGKLEPLL HN19.4 ADVDADQKRLEEVLGSVNYYKQLESDGFNVMKGAILGLPIIGGIIVGVARDNLGKLEPLL 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|. EEK50059.1 AELRQTVDYKVTLNRVVGVAYSNINEMHKALDDAINALTYMSTQWH HN1.1 AELRQTVDYKVTLNRVVGVAYSNINEMHKALDDAINALTYMSTQWH HN19.4 AELRQTVDYKVTLNRVVGVAYSNINEMHKALDDAINALTYMSTQWH
Hình 3.8. So sánh trình tự amino acid của protrein HBL vói trình tự EEK50059.1 trên ngân hàng gen quốc tế
B. cereus phân bố rất rô ̣ng rãi trong thực phẩm, tuy nhiên không phải tất cả các chủng B. cereus đều gây tiêu chảy (5), khả năng gây tiê u chảy cũng khác nhau phu ̣ thuô ̣c đă ̣c tính di truyền . Kết quả phân tích và so sánh trình tự gen
bceT, nhe và hblA cho thấy các gen này phân bố rô ̣ng rãi trong các loài thuô ̣c nhóm Bacillus cereus vớ i trình tự nucleotid khác nhau t uy nhiên trình tự acid amin của các protein này la ̣i tương đối giống nhau với đô ̣ tương đồng trên 95%, đặc biê ̣t đối với loài Bacillus thuringiensis. Điều này cũng đã được Asano và công sự công bố trước đây (3). Điều này cho thấy g en mã hóa các đô ̣c tố này không mang tính đă ̣c hiê ̣u loài và cũng tồn ta ̣i trong bô ̣ gen của các loài trong nhóm Bacillus cereus. Sự có mă ̣t của các gen này không quyết đi ̣nh khả năng gây ngộ độc thực phẩm của các chủng B. cereus. Độc tố HBL và đô ̣c tố NHE là 2 tổ hợp đô ̣c tố được cấu thành bởi 3 đô ̣c tố thành phần (HBL bao gồm L1, L2 và B; NHE bao gồm A, B và C) trong đó có 1 thành phần liên kết (binding protein) và 2 thành phần phân hủy (lytic protein). 3 gen mã hóa cho tổ hợp NHE cũng như 3 gen mã hóa tổ hợp HBL đều nằm operon . Tính gây đô ̣c tế bào của NHE phu ̣ thuô ̣c vào thành phần C (thành phần liên kết) (6) trong khi đó , sự biểu hiê ̣n của protein đô ̣c tố HBL phu ̣ thuô ̣c v ào sự có mặt của tất cả các gen mã hóa cho từng độc tố thành phần (4,7).
KẾT LUẬN
- Đã phân lập được 43 chủng vi khuẩn Bc từ các mẫu thực phẩm thu thập tại một số quán ăn vỉa hè trên địa bàn Hà Nội.
- Đã tách xác định khả năng mang các gen độc tố nhe, bcet, hbl của các chủng Bc phân lập.
- Đã tách dòng các gen nhe, bcet, hbl của 3 chủng HN1.1, HN7.9 và HN19.4 và so sánh với trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế. Dịch mã trên lý thuyết trình tự amino acid cho thấy:
+ Với gen bcet:
HN1.1 có 3 vị trí thay đổi (163: Q thành R , 175: A thành T , 222: F thành I) (98%) còn HN7.9 có 3 vị trí thay đổi (52: A thành T, 175: A thành T, 222: F thành I) (98%) so với trình tự có mã số BAA04134.1.
+ Với gen nhe:
HN7.9 có độ tương đồng 97% với trình tự amino acid số CO28519.1 trên ngân hàng gen. Trong đó, có 7 vị trí thay đổi (28: T thành S, 71: N thành K, 133: T thành A; 137: V thành S, 174: N thành D; 180: D thành N, 198: A thành S).
+ Với gen hbl, sau khi dịch mã lý thuyết có độ tương đồng 100% với trình tự amino acid có mã số EEK50059.1 trên ngân hàng gen quốc tế.
KIẾN NGHỊ
Các chủng Bc phân lập có khả năng các gen độc tố và có độ tương đồng không cao với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen điều này mở ra một hướng nghiên cứu mới về các chủng Bc phân lập tại Việt Nam. Vì vậy cần được tạo điều kiện để tiếp tục triển khai nghiên cứu sâu hơn phục vụ mục địch vệ sinh an toàn thực phẩm, y tế hay khoa học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Ngô Đình Bính, Nguyễn Xuân Cảnh, Phạm Kiều Thuý, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Thanh Hạnh. 2005. Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus cereus phân lập ở Việt Nam. Báo cáo khoa học Hội nghị về Vệ sinh an toàn thực phẩm, tháng 11- 2005, trang 120- 125.
2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. 2003. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo Dục.
3. Trần Đáng. 2002. Công tác truyền thông và chỉ đạo tuyến hoạt động bảo đảm chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Thanh Niên. 4. Lƣơng Đức Phẩm. 2002. Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm.
Nhà xuất bản Nông Nghiệp