3.3.3.1. Gen mã hóa độc tố BCET
DNA plasmid của các dòng khuẩn la ̣c trắng được tinh sa ̣ch và đo ̣c trình tự . Trình tự nucleotid của gen bcet ở chủng HN1.1 có 10 vị trí thay đổi và HN7.9 có 13 vị trí thay đổi so với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen (Mã số D17312) và với độ tương đồng 98%. Sau khi di ̣ch mã trên lý thuyết , trình tự protein được so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen quốc tế . Kết quả cho thấy trình tự protein có 221 acid amin trong đó , HN1.1 có 3 vị trí thay đổi (163: Q thành R, 175: A thành T, 222: F thành I) (98%) còn HN7.9 có 3 vị trí thay đổi (52: A thành T, 175: A thành T, 222: F thành I) (98%) so với trình tự có mã số BAA04134.1 (hinh 3.6). 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| BAA04134.1 RIGRSLGIHLILATQKPSGVVDDQIWSNSKFKLALKVQNTSDSNEILKTPDAAEITLPGR HN1.1 RIGRSLGIHLILATQKPSGVVDDQIWSNSKFKLALKVQNTSDSNEILKTPDAAEITLPGR HN7.9 RIGRSLGIHLILATQKPSGVVDDQIWSNSKFKLALKVQNTSDSNEILKTPDTAEITLPGR 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| BAA04134.1 AYLQVGNNEIYELFQSAWSGADYVENKEDKEHLDATIYAINDLGQYEILSEDLSGLGSSK HN1.1 AYLQVGNNEIYELFQSAWSGADYVENKEDKEHLDATIYAINDLGQYEILSEDLSGLGSSK HN7.9 AYLQVGNNEIYELFQSAWSGADYVENKEDKEHLDATIYAINDLGQYEILSEDLSGLGSSK 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| BAA04134.1 EVISVPSELDAVIDYIHDYAEINEIEALARPWLPPLPESVYLQDLHAIQFKEAWAKEKKP HN1.1 EVISVPSELDAVIDYIHDYAEINEIEALARPWLPPLPESVYLRDLHAIQFKEAWTKEKKP HN7.9 EVISVPSELDAVIDYIHDYAEINEIEALARPWLPPLPESVYLQDLHAIQFKEAWTKEKKP 190 200 210 220 ....|....|....|....|....|....|....|....|.. BAA04134.1 LQATVGLLDQPELQSQTPLTLDISKDGHVAVFSSPGYGKSTF HN1.1 LQATIGLLDQPELQSQTPLTLDISKDGHVAVFSSPGYGKSTI HN7.9 LQATVGLLDQPELQSQTPLTLDISKDGHVAVFSSPGYGKSTI
Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid của protrein BCET vói trình tự BAA041341 trên ngân hàng gen quốc tế
3.3.3.2. Gen mã hóa độc tố NHE
DNA plasmid của các dòng khuẩn la ̣c trắng được tinh sa ̣ch và đo ̣c trình tự . Trình tự nucleotid của gen bcet ở chủng HN 7.9 có 51 vị trí thay đổi so với
trình tự đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế (Mã số DQ153257.1) và có độ tương đồng 93%. Trình tự đã dịch mã trên lý thuyết được so sánh với trình tự protein có mã số ACO 28519.1. Kết quả cho thấy HN 7.9 có đoạn gen được dịch mã có 278 acid amin với đô ̣ tương đồng 97%, trong đó có 7 vị trí thay đổi (28: T thành S , 71: N thành K , 133: T thành A ; 137: V thành S , 174: N thành D; 180: D thành N, 198: A thành S) (hình 3.7). 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACO28519.1 MQKRFYKKCLLTLMIAGVATSNAFPLHTFAAEQNVKVLQENAKDYSLGPAGFQDVMAQTT HN7.9 MQKRFYKKCLLTLMIAGVATSNAFPLHSFAAEQNVKVLQENAKDYSLGPAGFQDVMAQTT 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACO28519.1 SSIFAMDSYANLIQNQQETDLSKISSINSEFKGNMMQHQRDAKINAAYWLDRMKPQIMKT HN7.9 SSIFAMDSYAKLIQNQQETDLSKISSINSEFKGNMMQHQRDAKINAAYWLDRMKPQIMKT 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACO28519.1 DQNIINYNNTFQTYYNVMLIAIDQKDSVKLKADLEKLYADIVKNQNEVDVLLGNLKAFRD HN7.9 DQNIINYNNTFQAYYNSMLIAIDQKDSVKLKADLEKLYADIVKNQNEVDVLLGDLKAFRN 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ACO28519.1 RMAKDTNSFKEDTNQLTAILASTNAGIPALEQQINTYNDSIKKSNDMVIAGGVLCVALIT
HN7.9 RMAKDTNSFKEDTNQLTSILASTNAGIPALEQQINTYNDSIKKSNDMVIAGGVLCVALIT
250 260 270 ....|....|....|....|....|....|....|...
ACO28519.1 CLAGGPMIAVAKKDIANAEREIANLKDRISGAQAEVAI
HN7.9 CLAGGPMIAVAKKDIANAEREIANLKDRISGAQAEVAI
Hình 3.7. So sánh trình tự amino acid của protrein NHE vói trình tự DQ153257.1 trên ngân hàng gen quốc tế
3.3.3.3. Gen mã hóa độc tố HBL
Trình tự nucleotid gen HBL của chủng HN 1.1 và HN19.4 cho thấy có 3 vị trí biến đổi với độ tương đồng 99% so với trình tự mang mã số L20441.1 trên ngân hàng gen quốc tế . Tuy nhiên 3 nucleotid biến đổi này không ảnh hưởng đến sự dịch mã tạo acid amin . Trình tự acid amin sau dịch mã có 106 acid amin với đô ̣ tương đồng 100% so với trình tự EEK50059.1 (hình 3.8).
10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EEK50059.1 ADVDADQKRLEEVLGSVNYYKQLESDGFNVMKGAILGLPIIGGIIVGVARDNLGKLEPLL
HN1.1 ADVDADQKRLEEVLGSVNYYKQLESDGFNVMKGAILGLPIIGGIIVGVARDNLGKLEPLL HN19.4 ADVDADQKRLEEVLGSVNYYKQLESDGFNVMKGAILGLPIIGGIIVGVARDNLGKLEPLL 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|. EEK50059.1 AELRQTVDYKVTLNRVVGVAYSNINEMHKALDDAINALTYMSTQWH HN1.1 AELRQTVDYKVTLNRVVGVAYSNINEMHKALDDAINALTYMSTQWH HN19.4 AELRQTVDYKVTLNRVVGVAYSNINEMHKALDDAINALTYMSTQWH
Hình 3.8. So sánh trình tự amino acid của protrein HBL vói trình tự EEK50059.1 trên ngân hàng gen quốc tế
B. cereus phân bố rất rô ̣ng rãi trong thực phẩm, tuy nhiên không phải tất cả các chủng B. cereus đều gây tiêu chảy (5), khả năng gây tiê u chảy cũng khác nhau phu ̣ thuô ̣c đă ̣c tính di truyền . Kết quả phân tích và so sánh trình tự gen
bceT, nhe và hblA cho thấy các gen này phân bố rô ̣ng rãi trong các loài thuô ̣c nhóm Bacillus cereus vớ i trình tự nucleotid khác nhau t uy nhiên trình tự acid amin của các protein này la ̣i tương đối giống nhau với đô ̣ tương đồng trên 95%, đặc biê ̣t đối với loài Bacillus thuringiensis. Điều này cũng đã được Asano và công sự công bố trước đây (3). Điều này cho thấy g en mã hóa các đô ̣c tố này không mang tính đă ̣c hiê ̣u loài và cũng tồn ta ̣i trong bô ̣ gen của các loài trong nhóm Bacillus cereus. Sự có mă ̣t của các gen này không quyết đi ̣nh khả năng gây ngộ độc thực phẩm của các chủng B. cereus. Độc tố HBL và đô ̣c tố NHE là 2 tổ hợp đô ̣c tố được cấu thành bởi 3 đô ̣c tố thành phần (HBL bao gồm L1, L2 và B; NHE bao gồm A, B và C) trong đó có 1 thành phần liên kết (binding protein) và 2 thành phần phân hủy (lytic protein). 3 gen mã hóa cho tổ hợp NHE cũng như 3 gen mã hóa tổ hợp HBL đều nằm operon . Tính gây đô ̣c tế bào của NHE phu ̣ thuô ̣c vào thành phần C (thành phần liên kết) (6) trong khi đó , sự biểu hiê ̣n của protein đô ̣c tố HBL phu ̣ thuô ̣c v ào sự có mặt của tất cả các gen mã hóa cho từng độc tố thành phần (4,7).
KẾT LUẬN
- Đã phân lập được 43 chủng vi khuẩn Bc từ các mẫu thực phẩm thu thập tại một số quán ăn vỉa hè trên địa bàn Hà Nội.
- Đã tách xác định khả năng mang các gen độc tố nhe, bcet, hbl của các chủng Bc phân lập.
- Đã tách dòng các gen nhe, bcet, hbl của 3 chủng HN1.1, HN7.9 và HN19.4 và so sánh với trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế. Dịch mã trên lý thuyết trình tự amino acid cho thấy:
+ Với gen bcet:
HN1.1 có 3 vị trí thay đổi (163: Q thành R , 175: A thành T , 222: F thành I) (98%) còn HN7.9 có 3 vị trí thay đổi (52: A thành T, 175: A thành T, 222: F thành I) (98%) so với trình tự có mã số BAA04134.1.
+ Với gen nhe:
HN7.9 có độ tương đồng 97% với trình tự amino acid số CO28519.1 trên ngân hàng gen. Trong đó, có 7 vị trí thay đổi (28: T thành S, 71: N thành K, 133: T thành A; 137: V thành S, 174: N thành D; 180: D thành N, 198: A thành S).
+ Với gen hbl, sau khi dịch mã lý thuyết có độ tương đồng 100% với trình tự amino acid có mã số EEK50059.1 trên ngân hàng gen quốc tế.
KIẾN NGHỊ
Các chủng Bc phân lập có khả năng các gen độc tố và có độ tương đồng không cao với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen điều này mở ra một hướng nghiên cứu mới về các chủng Bc phân lập tại Việt Nam. Vì vậy cần được tạo điều kiện để tiếp tục triển khai nghiên cứu sâu hơn phục vụ mục địch vệ sinh an toàn thực phẩm, y tế hay khoa học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Ngô Đình Bính, Nguyễn Xuân Cảnh, Phạm Kiều Thuý, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Thanh Hạnh. 2005. Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus cereus phân lập ở Việt Nam. Báo cáo khoa học Hội nghị về Vệ sinh an toàn thực phẩm, tháng 11- 2005, trang 120- 125.
2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. 2003. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo Dục.
3. Trần Đáng. 2002. Công tác truyền thông và chỉ đạo tuyến hoạt động bảo đảm chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Thanh Niên. 4. Lƣơng Đức Phẩm. 2002. Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm.
Nhà xuất bản Nông Nghiệp
5. Khuất Hữu Thanh. 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật.
Tài liệu tiếng Anh
6. Agaisse, H., Gominet, M., Okstad, O.A., Kolsto, A.B., and Lereclus, D.
1999. PlcR is a pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis. Molecular Microbiology 32(5), 1043-1053.
7. Agata, N., Mori, M., Ohta, M., Suwan, S.. et al. 1994. A novel dodecadepsipeptide, cereulide, isolated from Bacillus cereus causes vacuole formation in Hep-2 cells, FEMS Microbiol. Lett.121, 31-34. 8. Agata, N., Ohta, M., Arakawa, Y., and Mori, M. 1995a. The bceT gene
of Bacillus cereus encodes an enterotoxic protein. Microbiology 141(4), 983-988.
9. Agata, N., Ohta, M., Mori, M., Isobe, M. 1995b. A novel dodecadepsipeptide, cereulide, is an emetic toxin of Bacillus cereus. FEMS Microbiology Letters 129:17-20
10. Anderson, M., Mikkola, R., Helin, J., Anderson, M.C., Salkinoja- Salonen, M.1998. A novel sensitive bioassay for detection of Bacillus cereus emetic toxin and relaed depsipeptide ionophores. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1338- 1343.
11. Anderson, M.A., Jaackelainen. E.L. Shaheen, R., Pirhonen, T., et al.2004. Sperm bioassay for rapid detection of cereulide producing
Bacillus cereus in food and related environments. Int. J Food Microbiol,94, 175- 183.
12. Andersson, A., Granum, P.E., and Ronner, U. 1998. The adhesion of
Bacillus cereus spores to epithelial cells might be an additional virulence mechanism. International Journal of Food Microbiology 39(1-2), 93-99. 13. Andersson, A., Ronner, U. and Granum, P. E. 1995. What problem
does the food industry have the spore- forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens? International Journal of Food Microbiology 28, 145- 155.
14. AOAC. 1995. Differentiation of members of Bacillus cereus group: Microbiological method. Sec. 17.8.02, Method 983.26. In Official Methods of Analysis of AOAC International, 16th ed., P.A. Cunniff (Ed.), 54-55. AOAC International, Gaithersburg, MD.
15. Ash, C., and M.D. Collins. 1992. Comparative analysis of 23S ribosomal RNA gene sequences of Bacillus antharacis and emetic Bacillus cereus
determined by PCR direct sequencing. FESM Microbiol. Lett. 73, 75- 80 16. Banerjee, C., C.I. Bustamante, R. Wharton, E. Talley, and J. C.Wade.
1988. Bacillus infections in patients with cancer. Arch. Intern. Med. 148, 343- 346.
17. Beecher, D.J. and Macmillan, J. D. 1991. Characterization of the components of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infection and Immunity 59(5), 1778-84.
18. Beecher, D.J., Olesen, T.W., Somers, E.B., Wong, A.C.L. 2000. Evidence for contribution of tripatite hemolysin BL, phosphatidyleholine preferring phospholipase C, and collagenase to verulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infect. Immun. 68, 5269- 5276.
19. Beecher, D.J., Schoeni, J.L., and Lee Wong, A.C. 1995. Enterotoxic activity of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infection and Immunity 63(11), 4423-4428
20. Christiansson, A., Bertilsson, J. and Svensson, B. 1999. Bacillus cereus
spores in raw milk: factors affecting the contamination of milk during the grazing period. Journal of Dairy Science 82, 305- 314.
21. Clavel, T., Carlin, F., Lairon, D., Nguyen- The, C., Schmitt, P. 2004. Survival of Bacillus cereus spores and vegetative cells in acid media simulating human stomach. Journal of Applied Microbiology. 97(1): 214- 219.
22. Corry, D. Roberts, and F.A. Skiner (ed.). Isolation and indenfication methods for food poisoning organisms. Academic Press, London.
23. Drobniewski, F. A. 1993. Bacillus cereus and related species. Clin. Microbiol. Rev. 6, 324- 338.
24. Ehling- Schulz, M., Fricker, M., Scherer, S., 2004. Identification of emetic toxin producing Bacillus cereus strains by a novel molecular assay. FEMS Microbiol. Lett. 232,189- 195.
26. Ehling- Schulz, M., Vukov, N., Schulz, A., Shaleen, R., Anderson, M., Martlbauer, E., and Scherer, S., 2005. Indentification and partial characterization of the nonribosomal peptide synthetase gene responsible for cereulide production in emetic Bacillus cereus .Appl. Enviro. Microbiol. 71(1), 105- 113.
27. Fernandez, A., Ocio, M. J., Fernandez P. S., Rodrigo, M. and Martinez, A. 1999. Application of non- linear regression analysis to the estimation of kinetic parameters for two enterotoxigenic strains of
28. Finlay, W.J., Logan, N.A., Sutherland, A.D. 2000. Bacillus cereus
produces most emetic toxin at lower tempertures. Lett. Appl. Microbiol. 31, 385- 389.
29. Gaviria Rivera, A.M., Granum, P.E. and Priest, F.G. 2000. Common occurrence of enterotoxin genes and enterotoxicity in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiology Letter 190, 151- 155.
30. Granum, P.E. 2001. Bacillus cereus. In: Doyle, M. P., et al. (Eds), Food microbiology: Fundamentals and Frotiers. ASM Press, Washington, DC, pp. 373- 381.
31. Guinebretiere, M.H. and Nguyen- The, C. 2003. Sources of Bacillus cereus contamination in a pasteurised zucchini puree processing plant, differentiated by two PCR- based method. FEMS Microbiology Ecology 43, 207- 215.
32. Guinebretiere, M.H., Broussolle, V., Nguyen- The, C.2002. Enterotoxigenic profiles of food poisoning and food borne Bacillus cereus strains. J. Clin. Microbiol. 40, 3053- 3056.
33. Haggblom, M.M., Apetroaie, C., Anderson, M.A., Salkinoja- Salonen, M. S. 2002. Quantitative analysis of cereulide, the emetic toxin of
Bacillus cereus, produced under various conditions. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2479- 2483.
34. Hansen, B. M., Hendrikdisen, N. B. 2001. Dectection of enterotoxic
Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis. Appl. Environ. Microbiol. 67, 185- 189.
35. Hauge, S. 1955. Food poisoning caused by aerobic spore forming bacilli. J. App. Bacteriol. 18: 591- 595.
36. Jaakelainen, E.L., Haggblom, M.M., Andersson, M.A., Salkinoja- Salonen, M. S. 2004. Atmospheric oxygen and other conditions affecting the production of cereulide by Bacillus cereus in food. International Journal of Food Microbiology 96, 75- 83.
37. Jeffery, E. Rhodehamel and Stanley, M. Harmon. 1998. Bacillus cereus. Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revision A. Chapter 14.
38. Kramer, J.M and Gilbert, J.M. 1989. Bacillus cereus and other Bacillus
species. Ch. 2, In Foodborne Bacterial Pathogens, M.P.Doyle (Ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, p. 21-70.
39. Lund, T., and P.E. Granum. 1997. Comparison of biological effect of the two different enterotoxin complexes isolated from three different strains of Bacillus cereus. Microbiology 143:3329- 3336.
40. Mahler, H., Pasi, A., Kramer, J.M., Schulte, P., Scoging, A.C., Bar, W. and Krahenbuhl, S. 1997. Fulminant liver failure in association with the emetic toxin of Bacillus cereus (see comments). New England Journal of Medicine. 336, 1142-1148.
41. Marahiel, M.A., Stachelhaus, T. Mootz, H.D. 1997. Modular peptide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis. Chem. Rev. 97, 2651- 2673.
42. Mikkola, R., Saris, N.E., Grigoriew, P. A., Anderson, M.A. and Salkinoja- Salonen, M. S. 1999. Inophoretic properties and mitochonodrial effects of cereulide: the emetic toxin of B. cereus. Eur. J. Biochem. 263. 112- 117.
43. Murray R.E., Don J. Brenner Jonh G. Holt, Noel R. Krieg, et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol2. 529- 575.
44. Notermans, S., and C.A. Batt. 1998. A rick assessment approach for food borne Bacillus cereus and its toxins. J. Appl. Microbiol. Symp. Suppl. 84:51S- 61S.
45. Opinion of the Scientific Panel on Biological Hazards on Bacillus cereus and other Bacillus spp. in foodstuffs. The EFSA Journal. 2004. 175, 1- 49.
46. Paananen, A., Mikkola, R., Sareneva, T., Matikainen, S., et al. 2002 Inhibiton of human natural killer cells activity by cereulide, an emetic toxin from Bacillus cereus. Clin. Exp. Immumol. 129, 420- 428.
47. Peng, J.S., Tsai, W.C. and Chou, C.C. 2001. Surface characteristics of
Bacillus cereus and its adhesion to stainless steel. International Journal of Food Microbiology 65, 105- 111.
48. Pichayawasin, S., Kuse, M., Koga, K., Isobe, M., et al. 2003. Complexation of cyclic dodecadepsipeptide, cereulide with ammonium salts. Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 3507- 3512.
49. Pol, I. and Smith, E. J., 1999. Combined action of nisin and carvacrol on
Bacillus cereus and Listeria monocytogenes. Letters in Applied Microbiology 29, 166- 170.
50. Ray, B. 1992. Nisin of Lactococus lactis ssp lactus as a food biopreservative. Pp207- 264 in B. Ray and M. A. Daeschel (ed). Food Biopresevatives of Naturnal Origen. CRC Press Boca Raton Fla.
51. Shinagawa, K. 1990. Analytical methods for Bacillus cereus and other
Bacillus species. Int. J. Food Microbiol. 10, 1250- 141.
52. Shinagawa, K., Komuma, H., Sekita, H., Sugii, S. 1995. Emesis of rhesus monkeys induced by intragastric administration with the Hep- 2 vacuolation factor (cereulide) produced by Bacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett. 130, 87- 90.
53. Shinagawa, K., Ueno, Y., Hu, D., Ueda, S., Sugii, S. 1996. Mouse lethal activity of a HEp- 2 vacuolation factor, cereulide produced by Bacillus cereus isolated from vomiting- type food poisoning. J. Vet. Med. Sci. 58, 1027- 1029.
54. Svenson, B., Ekelund, K., Ogura, H. and Christiansson, A. 2004. Charactetisation of Bacillus cereus isolated from milk silo tanks at eight different dairy plants. International Dairy Journal 14, 17- 27.
55. Turgay, K., Marahiel, M. A.1994. A general approach for identifying and cloning peptide synthetase genes. Pept. Res. 7, 238- 241.
56. Vahey, J.B., and H.W. Flynn, Jr. 1991. Results in the management of
Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surg. 22: 681- 686.
57. Wijanands, L.M., Dufrenne, J.B., Van Leusden, F.M. The pathogenic mechanism of the diarrheal syndrome caused by Bacillus cereus. RIVM report 250912001/2002.
58. Yamada, S., Ohashi, E., Agata, N., Venkateswaran, K., 1999. Cloning and