PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.9. Laccase và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người
1.9.1. Tổng quan về laccase
Laccase (p-benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) là một polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxydase. Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử.
phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, polychlorinated biphenyl (PBC), dioxin và cả hợp chất vô cơ như iot. Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng phân tử, tính chất glycosyl hóa và các tính chất động học [28]. Laccse được phân bố rộng rãi ở cả thực vật, nấm đảm, nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn. Tuy nhiên cho đến nay, laccase chủ yếu được phát hiện ở nấm đảm (Basidomycetes với hoạt tính cao), đặc biệt là ở các loài nấm có khả năng phân hủy lignocellulose như Agaricus basidomyces, Botrytis cinerea, Chaetomium thmophilum,
Coprius, cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiatre, Pleurotus otreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor .v.v.
Trong những năm gần đây, laccase được đặc biệt quan tâm bởi những ứng dụng rộng rãi của nó trong xử lý môi trường và nhiều ngành công nghiệp khác nhau như dệt nhuộm, tổng hợp hữu cơ, thực phẩm và tiềm năng trong lĩnh vực mỹ phẩm, dược phẩm và bảo vệ sức khỏe con người.
1.9.2. Ứng dụng của lacacse trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe
Do tính đặc thù và bản chất sinh học của chúng nên laccase có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực y dược và đang được quan tâm nghiên cứu.
Chứng viêm da nhiễm độc do nhựa cây (kết quả của việc da tiếp xúc với các chất độc từ cây thường xuân, cây yến mạch hay cây sơn mà chủ yếu là từ nhựa) chủ yếu do urushiol- một chất độc là dẫn xuất của catechol gây nên. Khi urushiol bị oxy hóa trở thành dẫn xuất ο- quinone thì lại trở thành một chất không độc. Lacase thể hiện tính oxy hóa, polymer hóa và khử độc urushiol từ đó hạn chế được ảnh hưởng của chứng viêm da do nhiễm độc nhựa cây.
Một ứng dụng tiềm năng khác của laccase trong lĩnh vực này là dựa vào sự vận phát sinh iodine insitu. Laccase có thể oxy hóa iodide để tạo thành iodine- một
loại thuốc thử được sử dụng một cách rộng rãi như một loại thuốc tẩy. Việc ứng dụng hệ thống sinh iodine bằng hệ thống laccase- muối iodide để khử trùng mang lại nhiều tiến bộ hơn so với sử dụng trực tiếp iodine. Thứ nhất, muối iodide có tính ổn định và an toàn hơn so với I2 trong việc bảo quản, vận chuyển và sử dụng. Thứ hai là việc giải phóng iodine từ hệ laccase- iodide dễ dàng điều khiển (có thể điều chỉnh bằng hoạt độ
dược phẩm, nội thất, chăm sóc sức khỏe, khử trùng nước uống hay nước bể bơi cũng như trong việc tẩy sạch các dây quấn vô cùng nhỏ.
Ngoài ra laccase còn được ứng dụng trong công nghệ khử mùi vì laccase có khả năng oxy hóa nhiều hợp chất thiol và các hợp chất chứa sulphur. Thậm chí hệ laccase còn có khả năng khử những mùi hôi thối thành mùi thơm nhờ khả năng tấn công và biến đổi các phân tử hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây nên những mùi hôi thối này. Laccase còn được sử dụng như là chất xúc tác trong quá trình sản xuất các thuốc chống ung thư. Thậm chí laccase còn là thành phần của nhiều mỹ phẩm. Nhiều cảm biến sinh học có chứa laccase đã được phát triển cho các xét nghiệm miễn dịch và xác định glucose, các amin thơm và các hợp chất phenol (Kunamneu và đtg, 2008). Laccase tạo liên kết đồng hóa trị với các phân tử liên kết sinh học như kháng thể, kháng nguyên, DNA, RNA, biotin và streptavidin có thể được sử dụng như một enzyme đánh dấu cho các xét nghiệm phát hiện trong hóa học mô, hóa học miễn dịch, hóa học tế bào hay axit nucleic (Schmid và Urlacher, 2007).
Nấm dược liệu cũng chứa một số các enzyme như laccase, superoxide dismutase, glucose oxidase, và peroxidase. Các enzyme này cũng đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong các liệu pháp điều trị ung thư bằng cách ngăn chặn sự oxy hóa và ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư. Nhiều sản phẩm được tạo ra từ laccase như các nhân tố kháng khuẩn, giải độc hay chăm sóc sức khỏe con người. Laccase có thể được sử dụng trong quá trình tổng hợp các hợp chất phức tạp có dược tính như thuốc mê, thuốc kháng viêm, thuốc kháng sinh, an thần v.v., bao gồm triazolo(benzo)cycloalkyl thiadiazines, vinblastine, mitomycin, penicillin X dimer, cephalosporins và dimerized vindoline [98]. Ngoài ra, laccase đã được các nhà nghiên cứu chứng minh về hoạt động ức chế một cách đáng kể quá trình phiên mã ngược của HIV-1 [131]. Một laccase khác cũng đã được khẳng định về khả năng chống lại aceruloplasminemia (một bệnh rối loạn di truyền do đột biến ở gen). Cách đây vài năm, một phương pháp enzyme mới dựa trên laccase đã được phát triển để phân biệt đồng thời morphine và codeine trong các mẫu thuốc được tiêm vào hệ thống phát hiện.
1.10. Phương pháp phân tích sàng lọc CALUX
Dioxin và các chất ô nhiễm tương tự (các chất nồng độ thấp-Micropollutants) thường được phát hiện ở các nồng độ rất thấp trong mẫu sinh phẩm và mô trường. Các phương pháp phân tích cần có kỹ thuật, thiết bị đặc hiệu có độ nhạy cao như sắc ký khí độ phân giải cao pha loãng đồng vị (high-resolution gas chromatography- HRGC, sắc ký khí khối phổ độ phân giải- HRGC/HRMS, sắc ký khí lỏng khối phổ độ phân giải cao -LC/MS/MS) v.v. Các phương pháp này có hạn chế là lượng mẫu lớn để phân tích lớn (khoảng 15 ml), chi phí cao, thời gian dài.
Trong cơ thể con người nói riêng và sinh vật nói chung tồn tại các thụ thể. Mỗi thụ thể tương ứng với một chất hay một nhóm chất có đặc tính giống nhau và có khả năng liên kết đặc hiệu với các chất hay nhóm chất này. Khi các chất này đi vào cơ thể, nó sẽ được gắn một cách đặc hiệu với các thụ thể tương ứng và một protein vận chuyển tạo thành một phức hợp. Phức hợp này đi vào trong nhân tế bào (gọi là các yếu tố phản ứng) tham gia vào quá trình dịch mã tạo ra các protein khác nhau, tùy thuộc vào mức độ ô nhiễm của hợp chất ngoài môi trường. CALUX là một công cụ dựa vào sự biểu hiện gen đã nghiên cứu và áp dụng để phát hiện và định lượng các đơn chất hay hỗn hợp chất trong các mẫu sinh phẩm và môi trường. Nó gồm một dòng tế bào cải biến di truyền với DNA được chèn thêm một gen (reporter) luciferase để biểu hiện enzyme kết hợp với các yếu tố phản ứng gây ra sự phiên mã của các gen chèn vào (Hình 1.2). Phụ thuộc vào liều lượng của các hợp chất hóa học xâm nhập vào tế bào, tế bào sẽ sinh ra enzyme luciferase. Khi bổ sung cơ chất luciferin, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất thành hợp chất phát quang. Ánh sáng tạo thành sẽ được định lượng bằng một máy đo luminometer. Mức độ phát quang trong tế bào CALUX nhờ phần mềm chuyên dụng có thể tính được nồng độ các chất xác định. Các dòng tế bào CALUX có thể được thiết kế lại để phát hiện một số nhóm chất quan tâm. Hầu hết các ứng dụng của CALUX được định hướng và thành công nhất đầu tiên để phát hiện các chất độc hại trong môi trường như dioxin hay các hoocmon.
CALUX là một công nghệ sàng lọc hiệu quả vì nó dựa trên phép đo tổng các phối tử có hiệu quả trên một thụ thể. Không giống như các phân tích hóa học, CALUX có thể đo tất cả các hoạt tính trên thụ thể quan tâm. Những năm gần đây, các
định lượng được dioxin mà công cụ này còn đo được các chất như hoocmon, các chất ô nhiễm ở nồng độ thấp và nhóm các chất liên quan đến các chức năng của tế bào.
Kết quả phân tích bằng Calux đã được cộng đồng chung châu Âu, Hoa Kỳ, Nhật Bản.v.v. công nhận mang tính pháp lý như phân tích bằng HRGC/HRMS. Phương pháp này được phổ biến nhanh và rộng bởi hiệu quả kinh tế, thời gian và chi phí. Những ưu điểm trên đã giúp các nhà quản lý môi trường, y tế và hoạch định chính sách có thể nhanh chóng đưa ra quyết định trong các vấn đề liên quan đến ô nhiễm nói chung và dioxin nói riêng (http://www.biodetectionsystems.nl/).
Hình 1.2. Sơ lược về CALUX
Ngoài DR- CALUX là công nghệ rất phất triển cho đến ngày nay để xác định nồng độ tổng số TEQ của một hỗn hợp phức hệ các chất trong huyết thanh người (< 0.1ppt) thì hiện nay CALUX cũng đang được phát triển để xác định sự có mặt và hoạt tính của nhiều hợp chất khác trong cơ thể như các chất ô nhiễm nồng độ thấp hay các hoormon. Các hợp chất này tuy có hàm lượng rất thấp nhưng lại gây ra tác động nghiêm trọng đến sức khỏe con người, gây ra hậu quả tức thời và lâu dài như làm hỏng hệ nội tiết, gây ung thư và rất nhiều bệnh tật khác. Nhóm chất hiện nay được
EDCs). Chúng gây rối loạn hệ nội tiết của cơ thể và làm bất lợi cho sự phát triển, sinh sản, thần kinh, tim mạch và miễn dịch con người.
Danh mục tế bào CALUX của BDS bao gồm các phân tích sinh học liên quan đến các lĩnh vực như an toàn thực phẩm, nước, môi trường, dược phẩm/ hóa chất, sản phẩm tiêu dùng, các phép thử ở bệnh viện, các sản phẩm sinh học tế bào, các nguyên liệu đối chứng tham khảo và các sản phẩm khác (Bảng 1.4).
Bảng 1.4. Một số CALUX thông dụng
Các thụ thể trong nhân Các quá trình
Tên Mục đích Tên Mục đích
DR CALUX Dioxins NfkB CALUX Ìnlammation
PAH CALUX PAHs P21 CALUX Phá hủy DNA
ERα CALUX Estrogens Nrf2 CALUX Mất cân bằng oxy
ERβ CALUX Estrogens P53 CALUX Phá hủy DNA
AR CALUX Androgens TCF CALUX Carcinogenesis
PR CALUX Progestins AP1 CALUX Stress
GR CALUX Glucocorticoid HIF1α CALUX Hypoxia
TRβ CALUX Thyroids ESRE CALUX Stress ER
RAR CALUX Retinoids Cytoxox CALUX cytotoxicity
PPARγ CALUX Obesogens
PPARα CALUX Obesogens
PPARδ CALUX Obesogens
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vi sinh vật
Các chủng nấm đảm
Các mẫu nấm tự nhiên được thu thập từ các nguồn và thuộc các đề tài khác nhau từ: Vườn Quốc gia Xuân Sơn- tỉnh Phú Thọ, Vườn Quốc gia Ba Vì- thành phố Hà Nội, A Lưới- tỉnh Thừa Thiên Huế, Vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà, Rừng Mã Đà- tỉnh Đồng Nai và rừng keo thuộc tỉnh Bình Phước được sử dụng để phân lập các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase và exopolysaccharide.
Vi sinh vật kiểm định
Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm Aspergillus niger và Penicillium italicum; 2 chủng vi khuẩn Bacillus cereus và Micrococus luteus từ Viện Hóa sinh biển.
Dòng tế bào được sử dụng trong các phân tích sàng lọc CALUX là các dòng tế bào liên kết mô xương ở người được gắn reporter gen luciferaza với với thụ thể tương ứng. Môi trường nuôi cấy dòng tế bào là DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12).
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất sử dụng để nghiên cứu là các hóa chất tinh khiết, đảm bảo chất lượng được nhập ngoại từ các hãng Sigma, Merk, Aldrich và các hóa chất thông thường khác. Cặp mồi sử dụng để phân loại các chủng nấm ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG và ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATCC.
Nghiên cứu này được thực hiện với các máy móc, thiết bị với độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học tái tạo môi trường và phòng Thí nghiệm trọng điểm quốc gia về gene thuộc Viện Công nghệ sinh học. Các thiết bị chính bao gồm: Cân kỹ thuật, máy đo pH Hanna, tủ cấy vô trùng Laminar của Pháp, tủ sấy, nồi khử trùng,
tủ lạnh các loại 40C, -200, máy đo quang phổ Novaspec II, lò vi sóng, pipet man các loại của hãng Eppendorf, bình nón, đầu côn, ống ly tâm v.v.
Ngoài ra nghiên cứu còn sử dụng thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AVANCE 500 của Trung tâm ứng dụng quang phổ- Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.
Phần sử dụng công nghệ CALUX được phối hợp thực hiện và thuộc bản quyền của BioDetection Systems (BDS, Amsterdam, Hà Lan), là 1/58 thành viên của BE- Basic Foundation, Hà Lan. Tổ chức này đã ký hợp tác KHCN với Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng nấm
Các mẫu nấm tự nhiên được cắt nhỏ với kích thước khoảng 0,5- 1cm đặt lên đĩa thạch có chứa sẵn môi trường PDA (dịch chiết khoai tây 200g/l; glucose 20g/l, aga 18g/l) bổ sung guaicol làm chất chỉ thị và các đĩa thạch này được nuôi ở 300C trong thời gian 1 – 3 ngày sau đó được tách và làm sạch. Các chủng nấm phân lập được được giữ trong lọ nhỏ với dung tích 10ml ở 4oC hoặc trong parafin oil để bảo quản lâu dài.
2.2.2. Phương pháp phân loại nấm dựa vào xác định trình tự ITS
Các chủng nấm được phân loại theo hình thái và xác định trình tự vùng ITS1- 5,8S-ITS2. Các chủng nấm được nuôi trên đĩa petri chứa môi trường PDA, sau 5 ngày nuôi cấy, sợi nấm được sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Cặp mồi ITS1 và ITS4 có
trình tự ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG và ITS4:
TCCTCCGCTTATTGATATCC [137] được sử dụng để khuếch đại trình tự ITS từ DNA tổng số của chủng nấm nghiên cứu. Sản phẩm DNA sau khi được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR được làm sạch bằng kit QIAGen. Trình tự ITS của các chủng nấm được xác định bằng máy xác định trình tự nucleotide tự động ABI 3730 và được so sánh với
dựng cây phát sinh chủng loại của chủng nấm nghiên cứu.
2.2.3. Chuẩn bị giống
Các chủng nấm được cấy trên môi trường PDA ở 30oC trong 4 ngày. Sau đó, chúng được chuyển sang bình tam giác 250ml chứa 100ml môi trường PDB (200g/l dịch chiết khoai tây; 20g/l glucose) nuôi lắc ở 150 vòng/phút, 30oC sau 7 ngày nuôi cấy được đồng nhất và sử dụng làm giống cho các thí nghiệm.
2.2.4. Phương pháp xác định sinh khối và hàm lượng exopolysaccharide
Bình tam giác 250ml chứa 100ml môi trường PGM (200g/l dịch chiết khoai tây; 20 g/l glucose; 5g/l cao malt; 1g/l peptone; 1g/l KH2PO4, pH6) được bổ sung 5% giống, nuôi lắc ở 150 vòng/phút, 30oC. Sau 10 ngày nuôi cấy, tách sinh khối khỏi dịch lên men bằng cách ly tâm ở 8000 vòng/phút, 15 phút.
Exopolysaccharide thô trong dịch nuôi cấy được tách ra khỏi hỗn hợp lỏng bằng phương pháp kết tủa sử dụng ethanol 96% tỉ lệ 1:4 thể tích, giữ ở 4oC qua đêm. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, phần lắng xuống là exopolysaccharide cần thu. Rửa exopolysaccharide 3 lần bằng ethanol, sau đó sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi để xác định lượng exopolysaccharide thu được.
Phần sinh khối nấm sau khi ly tâm được rửa sạch lại bằng nước cất, sau đó sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi để xác định lượng sinh khối thu được.
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính enyme laccase
Hoạt tính laccase được xác định dựa trên sự oxy hóa ABTS của enzyme laccase tạo thành hợp chất hấp thụ ở bước sóng 420 nm. Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để tạo thành 1µM sản phẩm từ ABTS (2,2'-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) trong thời gian 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [32]. Một phản ứng đo enzyme laccase bao gồm 600µl đệm axetat 20mM pH3, 200 µl ABTS 2,5mM, 200 µl mẫu thí nghiệm. Xác định giá trị OD ở thời điểm t=0 và thời điểm τ.
U= E f pu V D V OD OD 0) 106 (
Trong đó: U: Hoạt độ enzyme (U/l)
: hệ số hấp thụ ánh sáng của sản phẩm ở bước sóng 420 nm (420= 36 000 M-1cm-1)
Vpư: Tổng thể tích phản ứng (1 ml) VE: Thể tích enzyme (0,2 ml)
ODτ : Giá trị OD đo được tại thời điểm
OD0: Giá trị OD đo được tại thời điểm =0 Df: Độ pha loãng
2.2.6. Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase
2.2.6.1. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường
Hai chủng nấm FPT31 và FMD12 được nuôi cấy trên môi trường PGM tại các các giá trị pH từ 3 đến 10. Hoạt tính enzyme laccase được xác định sau mỗi ngày nuôi