3.1. Phân lập và phân loại các chủng nấm nghiên cứu
Các mẫu thu thập từ nhiều đợt lấy mẫu và được phân lập từ các khu vực rừng có khí hậu và đặc điểm sinh thái khác nhau gồm Vườn Quốc gia Xuân Sơn- tỉnh Phú Thọ, Vườn Quốc gia Ba Vì- thành phố Hà Nội, A Lưới- tỉnh Thừa Thiên Huế, Vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà, Vườn Quốc gia Mã Đà- tỉnh Đồng Nai và tỉnh Bình Phước và thuộc các dự án, đề tài khác nhau. A Lưới và Mã Đà là hai khu vực bị rải chất độc hóa học nặng nề trong chiến tranh chống Mỹ. Các khu vực lấy mẫu này có khí hậu cũng như hệ sinh vật khác nhau. Các mẫu nấm sử dụng để phân lập có hình thái quả thể nấm rất khác nhau, hầu hết chúng thuộc nhóm nấm cứng. Mười hai chủng nấm đã được phân lập và 10/12 chủng đã được tiến hành định danh. Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch của các chủng nấm phân lập được cũng khác nhau (bảng 3.2). Dựa vào trình tự vùng ITS1-5,8S- ITS2 và so sánh với các trình tự đã được công bố trên GenBank thì 10 chủng nấm đã được xác định thuộc các chi Ganoderma, Trametes, Earliella và Inonotus và Panus
(bảng 3.2).
Trong số 10 chủng đã được phân loại có 6 chủng thuộc chi Ganoderma bao gồm FMD12, FMD13, FMD16, FAL18, FPT47 và FBV334. Các chủng FMD12, FMD13 và FMD16 có độ tương đồng 99% chủng Ganoderma sp. G31 (KR093030) và 97% với
chủng Ganoderma sp. FIRM138 (AJ698114). Ganoderma sp. G31 là nấm được phân lập từ cây dầu cọ bị mục gốc ở vùng Miri, Malaysia và đã được xác định là thuộc loài G. zonatum [168]. Ganoderma sp. FIRM138 là nấm được phân lập từ cây keo tai tượng bị
thối rễ ở Indonesia và được cho là gây nên bệnh thối đỏ rễ ở loài keo này và cũng được xếp vào loài G. philippii [70]. Các chủng FAL18, FPT47 và FBV334 có độ tương đồng 99% với lần lượt với các chủng Ganoderma mastoporum voucher TNM-F0018835 (JX840351), Ganoderma gibbosum strain T160 (KJ654373) và Ganoderma lobatum
isolate JV 0409/13J (KF605675). Bảng 3.1 so sánh độ tương đồng giữa các Ganoderma
Bảng 3.1. Độ tương đồng giữa các nấm thuộc Ganoderma từ các vùng Cặp nấm so sánh Độ tương đồng (%) Cặp nấm so sánh Độ tương đồng (%) FMD12 – FMD13 99 FMD13 – FAL18 95 FMD12 – FMD16 99 FMD13 – FPT47 93 FMD13 – FMD16 99 FMD13 – FBBV334 92 FMD12 – FAL18 95 FAL18 – FPT47 93 FMD12 – FPT47 93 FAL18 – FBV334 92 FMD12 – FBV334 92 FPT47 – FBV334 99
Kết quả nhận được khá thú vị. Các nấm được phân lập ở cùng một khu vực (Mã Đà) hoặc ở hai khu vực gần nhau (Ba Vì và Xuân Sơn) thì có độ tương đồng với nhau cao đến 99%. Các Ganoderma được phân lập ở các khu vực khá xa nhau thì có độ tương đồng thấp. Độ tương đồng của các Ganoderma phân lập từ A Lưới và Mã Đà là 95%,
trong khi đó giá trị này của các Ganoderma từ Mã Đà với Xuân Sơn, Ba Vì hay A Lưới với Xuân Sơn, Ba Vì chỉ khoảng 92-93%. Như vậy, các nấm Ganoderma ở 3 miền Bắc, Trung, Nam là tương đối khác nhau, càng xa nhau về mặt địa lý và điều kiện tự nhiên thì các nấm này càng thể hiện sự khác biệt về mặt di truyền.
Earliella scabrosa
voucher UOC DAMIA D37 (KR706167) phân lập từ Malaysia và Earliella scabrosa
isolate UTAR R8 (KJ867374) phân lập từ Sri Lanka. FAL11 tương đồng 99% với
Inonotus pachyphloeus CBS 193.37 (KM030575) và một số nấm thuộc loài I. pachyphloeus. Chủng FBD167 tương đồng 94% với chủng nấm Panus conchatus isolate
X1234 (JN710579) và Panus conchatus voucher JMH44 (KM267730). Tương tự, FPT24 cũng tương đồng 99% với chủng Trametes elegan strain UMT170-T (KJ654414) và một số nấm thuộc loài T. elegan. Như vậy, dựa trên các đặc điểm về hình thái quả thể, sợi
nấm và kết hợp với các số liệu về độ tương đồng của vùng trình tự ITS của các nấm nghiên cứu với các trình tự trên GenBank, các chủng FPT31, FAL11, FBD167, và FPT24 được đặt tên tương ứng là Earliella. sp FPT31, Inonotus sp. FAL11, Panus sp. FBD167 và Trametes sp. FPT24.
3.2. Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp exopolysaccharide và hoạt tính enzyme laccase của các chủng nấm nghiên cứu
Hầu hết các khuẩn lạc đều tạo màu nâu đỏ trên môi trường thạch có bổ sung chất chỉ thị guaiacol 0,2% chứng tỏ khả năng sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoreductase (laccase) và peroxidase (mangan peroxidase, lignin peroxidase). Bảng 3.2 thể hiện một số đặc điểm của các chủng nấm được phân lập và sàng lọc.
Bảng 3.2. Hình thái các chủng nấm và khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase của chúng
Tên chủng Nguồn gốc Hình ảnh tự nhiên Hình ảnh khuẩn lạc Sinh khối (g/l) Polysaccharide (g/l) Hoạt tính laccase (U/l) Earliella sp. FPT31 (KT965504) Rừng Quốc gia Xuân Sơn 4,64 0,84 7.923 Trametes sp. FPT24 (KT965503) Rừng Quốc
gia Xuân Sơn 4,37 3,24 944
Ganoderma sp.
FPT47 (KT965499)
Rừng Quốc
Ganoderma sp. FBV334 (KT965498) Rừng Quốc gia Ba Vì 6,38 0,36 2.573 FMD11 (Chưa phân loại) Rừng Quốc gia Mã Đà 5,12 2,09 0 Ganoderma sp. FMD12 (KT965500) Rừng Quốc gia Mã Đà 5,40 1,32 12 Ganoderma sp. FMD13 (KT965501) Rừng Quốc gia Mã Đà 3,26 1,09 18
Ganoderma sp. FMD16 (KT965502) Rừng Quốc gia Mã Đà 5,29 1,03 0 Inonotus sp. FAL11 Đồi Thịt Băm- A Lưới 6,26 0,39 1.000 Ganoderma sp. FAL18 (KT965495) Đồi Thịt Băm- A Lưới 5.15 1,11 12 D12 (Chưa phân loại) Bình Phước 5,56 0,15 0 Panus sp. FBD167 (KT965505) Rừng Quốc gia BiDoup 8,79 1,21 2.439
lên men không có sự sai khác quá lớn, sinh khối khô thu được có khối lượng từ 3,26 đến 6,28 g/l. Tám chủng trong số 12 chủng sau khi sàng lọc có khả năng sinh polysaccharide trên môi trường nuôi cấy với khối lượng lớn hơn 1g/l. Cũng có 8/12 chủng có khả năng sinh enzyme laccase với hoạt tính từ 12 đến 7.923 U/l. Tuy nhiên, các chủng sinh tổng hợp laccase có hoạt tính cao lại không có khả năng sinh tổng hợp EPS cao. Kết quả này có thể do điều kiện để sinh tổng hợp hai sản phẩm nêu trên khác nhau. Việc lựa chọn môi trường để các chủng nấm này có thể sinh tổng hợp đồng thời 2 sản phẩm trên có ý nghĩa vô cùng quan trọng để ứng dụng các sản phẩm thu được trong các lĩnh vực khác nhau, đặc biệt trong lĩnh vực tạo nguyên liệu cho việc sản xuất các sản phẩm trong công nghiệp dược liệu và nông nghiệp hữu cơ.
Các chủng nấm được phân lập từ các khu vực khác nhau cũng thể hiện những đặc điểm khác nhau rõ rệt. Ba chủng nấm phân lập từ rừng Quốc gia Xuân Sơn tỉnh Phú Thọ đều có khả năng sinh tổng hợp EPS khá tốt từ 0,84 đến 3,24 g/l, 2/3 chủng sinh enzyme với hoạt tính cao, đặc biệt chủng FPT24 vừa sinh tổng hợp EPS tốt với giá trị EPS thu được là 3,24g/l, vừa sinh tổng hợp enzyme laccase cao với hoạt tính thu được ở khảo sát ban đầu là 944 U/l. Chủng nấm Ganoderma sp.FBV334 phân lập từ Vườn Quốc gia Ba Vì có hoạt tính laccase đạt được 2.573 U/l nhưng EPS thu được chỉ là 0,36g/l. Chủng nấm D12 phân lập từ Bình Phước không thể hiện hoạt tính laccase, đồng thời lượng EPS sinh ra cũng rất thấp (0,15g/l). Được phân lập từ Vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà tỉnh Lâm Đồng, chủng FBD167 vừa có khả năng sinh tổng hợp EPS tốt (1,21 g/l) đồng thời sinh laccase có hoạt tính cao (2.439 U/l). Bốn chủng nấm phân lập được từ Vườn Quốc gia Mã Đà tỉnh Đồng Nai đều thể hiện khả năng sinh EPS ở mức trung bình đến khá từ 1,02 đến 2,09g/l nhưng sinh laccase thu được có hoạt tính thấp. Hai chủng nấm phân lập từ A Lưới tỉnh Thừa Thiên Huế đều có khả năng sinh trưởng tốt, chủng FAL11 sinh laccase hoạt tính cao 1.000U/l nhưng sinh tổng hợp EPS thấp, trong khi đó chủng FAL18 lại sinh EPS đạt 1,1g/l nhưng hoạt tính laccase lại chỉ đạt 12U/l. Mã Đà và A Lưới là hai khu vực bị rải chất độc hóa học rất nặng nề trong chiến tranh, điều này ảnh
hưởng khá lớn đến hệ sinh thái ở các khu vực này. Để có những kết luận chính xác và thuyết phục cần có nhiều nghiên cứu trên nhiều đối tượng nấm hơn nữa nhưng các kết quả trong nghiên cứu này cũng đã phần nào phác họa, so sánh về đặc điểm của nấm ở các khu vực khác nhau.
Cho đến nay đã có nhiều công bố về khả năng sinh tổng hợp polysaccharide, các tính chất và ứng dụng của các nấm thuộc chi Ganoderma trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong lĩnh vực tăng cường và bảo vệ sức khỏe con người [20], [36], [143], [61], [135], [56]. Các nấm thuộc chi Inonotus và Trametes và Panus cũng đã có một số nghiên cứu công bố về khả năng sinh tổng hợp polysaccharide, enzyme laccase và một số hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học [19], [144], [44], [76], [77], [151]. Loài nấm Earliella scabrosa đã được công bố về khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase và mangan
peroxidase khi lên men rắn trên môi trường bã mía với hoạt tính lần lượt là 44,3 và 3.692 U/g; đồng thời nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng enzyme thô thu từ chủng này có khả năng loại màu thuốc nhuộm Navy FNB và Red FN-3G [43]. Một nghiên cứu khác của Peng và đtg (2013) cũng đã công bố chủng nấm Earliella scabrosa phân lập từ rừng của Malaysia có khả năng ức chế một số nấm mục gây bệnh cho cây cao su [100]. Thêm nữa, theo nghiên cứu của Liew và đtg (2015) đã cho thấy dịch chiết trong ethanol của E. scabrosa đặc tính chống oxy hóa với giá DPPH đạt 21,27 % đồng thời có khả năng ức
chế sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn kiểm định gây bệnh Clostridium difficile, Streptococus pyogenies, Pseudomonas aeruginos, Staphylococcus aureus và Escherichia coli [68]. Tuy nhiên lại có rất ít các nghiên cứu đã công bố về khả năng sinh tổng hợp
polysaccharide của các loài nấm thuộc chi Earliella. Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên
cứu về nấm đảm vừa có khả năng sinh tổng hợp polysaccharide vừa sinh tổng hợp enzyme laccase. Nhìn vào bảng 3.2 có thể thấy chủng nấm Earliella sp. FPT31 có khả
năng sinh tổng hợp đồng thời polysaccharide (0,84 g/l) và enzyme laccase (7.923 U/l) trong khi đó chủng nấm FMD12 có khả năng sinh polysaccharide tương đối tốt (1.02 g/l) nhưng không có khả năng sinh tổng hợp laccase. Dựa trên một số đặc điểm khác nhau về nguồn gốc, hình thái v.v. thì 2 chủng nấm nghiên cứu đã được lựa chọn để khảo sát ảnh
hưởng của một số điều kiện nuôi cấy và khả năng kháng lại một số vi sinh vật gây bệnh kiểm định để hướng tới sử dụng chúng trong đấu tranh sinh học.
3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy một số chủng nấm
Dịch nuôi cấy của 7 chủng nấm là FPT31, FPT47, FBV334, FMD12, FMD13, FMD16 và D12 được sử dụng để khảo sát và đánh giá khả năng kháng lại 4 chủng vi sinh vật kiểm định gồm Aspergillus niger, Penicillium italicum, Bacillus cereus và Micrococus luteus. Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp xác định đường kính
vòng ức chế (inhibit zone) trên môi trường thạch.
FMD12- Bacillus cereus FMD12-Micrococus luteus
FPT31- B. cereus FPT31- M.luteus
Hình 3.3. Khả năng kháng Bacillus cereus và Micrococus luteus của dịch nuôi từ nấm FPT31 và FMD12
Chỉ có dịch lên men của 2 chủng nấm Earliella sp. FPT31 và Ganoderma sp.
hiện thấy khả năng kháng lại các vi sinh vật kiểm định.
Dịch nuôi cấy của chủng FMD12 có khả năng ức chế sự phát triển của 2 vi khuẩn kiểm định là B. cereus và M. luteus với đường kính vòng ức chế lần lượt là 12 mm và 16 mm. Trong khi đó, dịch nuôi cấy của chủng FPT31 ức chế yếu hơn, đường kính vòng ức chế là 2 mm đối với B. cereus và 4 mm đối với M. luteus.
Dịch nuôi cấy của chủng FMD12 tiếp tục được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của hai chủng vi khuẩn kiểm định B. cereus và M.luteus trong môi trường dịch thể. Thí nghiệm được tiến hành đối với 2 tỉ lệ môi trường: dịch nuôi lần lượt là 1:1 (50% dịch nuôi nấm) và 1:2 (25% dịch nuôi nấm). Độ đục của các mẫu thí nghiệm được xác định độ đục sau 12 giờ và 24 giờ. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khả năng ức chế sự sinh trưởng 2 chủng vi khuẩn B. cereus và M. luteus của dịch nuôi cấy chủng FMD12
Vi khuẩn kiểm định Sau 12 giờ Sau 24 giờ
25% 50% 25% 50%
B. cereus 55,26 81,58 35,42 75,00
M.luteus 49,02 68,62 61,62 80,81
Sau 12 giờ, 50% dịch nuôi cấy của chủng FMD12 trong môi trường có khả năng ức chế đến 81,58% sự sinh trưởng của B. cereus và 68,62% của M.luteus so với mẫu đối chứng không có dịch nuôi cấy nấm. Nếu trong môi trường có chứa 25% dịch nuôi nấm thì các giá trị trên lần lượt là 55,26 và 49,02%. Sau 24 giờ nuôi cấy, khả năng ức chế của dịch nuôi nấm đối với B. cereus giảm còn 75 và 35,42%, trong khi đó khả năng ức chế sự sinh trưởng của M. luteus lại tăng lên 80,81 và 61,62% (bảng 3.).
Theo nghiên cứu của Peng và đtg (2013), dịch chiết từ sinh khối của nấm
Earliella scabrosa trong nước và methanol đều có khả năng kháng lại 7 chủng nấm gây
độ ức chế tối thiểu) từ 0,61 đến 5µg/µl [100].
Theo kết quả đã công bố của một số nghiên cứu quốc tế khác, dịch chiết từ quả thể của nhiều nấm đảm có khả năng kháng lại B. cereus hoặc M.luetus hoặc kháng lại cả hai. Dịch chiết trong methanol của Agaricus bisporus thể hiện khả năng kháng lại cả B. cereus và M. luteus và một số vi khuẩn Gram dương khác nữa như Micrococcus flavus, Staphylococcus aureus và Epidermidis Staphylococcus [11], [96], [97]. Dịch chiết trong methanol của Agaricus silvicola cũng kháng lại vi khuẩn Gram dương Bacillus cereus
(MIC = 5μg / mL), Bacillus subtilis (MIC = 50μg / mL).
Chiết xuất thu được ở 2 loại dung môi methanol và ethyl acetate của Lepista nuda đều có hoạt tính kháng khuẩn tốt với Bacillus cereus [55], [96].
Ganoderma lucidum là một trong những nấm dược liệu nổi tiếng nhất. Nhiều dịch
chiết khác nhau từ loài nấm linh chi này đã được đánh giá là có hiệu quả như nhau khi so sánh với sulphate gentamycin, trong đó dịch chiết bởi acetone cho hiệu quả cao nhất. Dịch chiết bởi các dung môi đã nghiên cứu từ nấm này đều ức chế được các vi khuẩn
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi [39], [105], [115]. Tuy nhiên trong nghiên cứu đã được công bố bởi Sheena và đtg (2003) thì chiết xuất của nó trong methanol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn lại rất thấp [115]. Các tác giả khác cũng đã đánh giá dịch chiết từ nấm bởi nước ức chế được 15 loại vi khuẩn Gram dương và Gram âm, và mức ức chế cao nhất là kháng lại Micrococcus luteus [39]. Mothana và đtg (2000) cũng đã chứng minh khả năng kháng vi sinh vật của các hợp chất Ganomycins A and B tách chiết từ Ganoderma pfeifferi kháng lại các vi khuẩn
3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo sinh khối, sinh tổng hợp EPS và laccase của 2 chủng nấm Earliella sp. FPT31 và Ganoderma sp. FMD12
3.4.1.Ảnh hưởng của pH môi trường
pH của môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng và ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật nói chung, nấm dược liệu nói riêng. Mỗi vi sinh vật lại có một pH tối thích cho sự tạo thành sinh khối khác nhau. Ngoài ra, ở các pH khác nhau, các sản phẩm của quá trình lên men cũng có thể khác nhau. Chưa có một quy luật chung nào về ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học ở vi sinh vật. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp enzyme laccase và polysaccharide của hai chủng nấm FPT31 và FMD12 đã được khảo sát với dải pH từ 3 đến 9. Kết quả được trình bày ở hình 3.4.
Giá trị pH của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và sinh