PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng nấm
Các mẫu nấm tự nhiên được cắt nhỏ với kích thước khoảng 0,5- 1cm đặt lên đĩa thạch có chứa sẵn môi trường PDA (dịch chiết khoai tây 200g/l; glucose 20g/l, aga 18g/l) bổ sung guaicol làm chất chỉ thị và các đĩa thạch này được nuôi ở 300C trong thời gian 1 – 3 ngày sau đó được tách và làm sạch. Các chủng nấm phân lập được được giữ trong lọ nhỏ với dung tích 10ml ở 4oC hoặc trong parafin oil để bảo quản lâu dài.
2.2.2. Phương pháp phân loại nấm dựa vào xác định trình tự ITS
Các chủng nấm được phân loại theo hình thái và xác định trình tự vùng ITS1- 5,8S-ITS2. Các chủng nấm được nuôi trên đĩa petri chứa môi trường PDA, sau 5 ngày nuôi cấy, sợi nấm được sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Cặp mồi ITS1 và ITS4 có
trình tự ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG và ITS4:
TCCTCCGCTTATTGATATCC [137] được sử dụng để khuếch đại trình tự ITS từ DNA tổng số của chủng nấm nghiên cứu. Sản phẩm DNA sau khi được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR được làm sạch bằng kit QIAGen. Trình tự ITS của các chủng nấm được xác định bằng máy xác định trình tự nucleotide tự động ABI 3730 và được so sánh với
dựng cây phát sinh chủng loại của chủng nấm nghiên cứu.
2.2.3. Chuẩn bị giống
Các chủng nấm được cấy trên môi trường PDA ở 30oC trong 4 ngày. Sau đó, chúng được chuyển sang bình tam giác 250ml chứa 100ml môi trường PDB (200g/l dịch chiết khoai tây; 20g/l glucose) nuôi lắc ở 150 vòng/phút, 30oC sau 7 ngày nuôi cấy được đồng nhất và sử dụng làm giống cho các thí nghiệm.
2.2.4. Phương pháp xác định sinh khối và hàm lượng exopolysaccharide
Bình tam giác 250ml chứa 100ml môi trường PGM (200g/l dịch chiết khoai tây; 20 g/l glucose; 5g/l cao malt; 1g/l peptone; 1g/l KH2PO4, pH6) được bổ sung 5% giống, nuôi lắc ở 150 vòng/phút, 30oC. Sau 10 ngày nuôi cấy, tách sinh khối khỏi dịch lên men bằng cách ly tâm ở 8000 vòng/phút, 15 phút.
Exopolysaccharide thô trong dịch nuôi cấy được tách ra khỏi hỗn hợp lỏng bằng phương pháp kết tủa sử dụng ethanol 96% tỉ lệ 1:4 thể tích, giữ ở 4oC qua đêm. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, phần lắng xuống là exopolysaccharide cần thu. Rửa exopolysaccharide 3 lần bằng ethanol, sau đó sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi để xác định lượng exopolysaccharide thu được.
Phần sinh khối nấm sau khi ly tâm được rửa sạch lại bằng nước cất, sau đó sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi để xác định lượng sinh khối thu được.
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính enyme laccase
Hoạt tính laccase được xác định dựa trên sự oxy hóa ABTS của enzyme laccase tạo thành hợp chất hấp thụ ở bước sóng 420 nm. Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để tạo thành 1µM sản phẩm từ ABTS (2,2'-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) trong thời gian 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [32]. Một phản ứng đo enzyme laccase bao gồm 600µl đệm axetat 20mM pH3, 200 µl ABTS 2,5mM, 200 µl mẫu thí nghiệm. Xác định giá trị OD ở thời điểm t=0 và thời điểm τ.
U= E f pu V D V OD OD 0) 106 (
Trong đó: U: Hoạt độ enzyme (U/l)
: hệ số hấp thụ ánh sáng của sản phẩm ở bước sóng 420 nm (420= 36 000 M-1cm-1)
Vpư: Tổng thể tích phản ứng (1 ml) VE: Thể tích enzyme (0,2 ml)
ODτ : Giá trị OD đo được tại thời điểm
OD0: Giá trị OD đo được tại thời điểm =0 Df: Độ pha loãng
2.2.6. Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase
2.2.6.1. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường
Hai chủng nấm FPT31 và FMD12 được nuôi cấy trên môi trường PGM tại các các giá trị pH từ 3 đến 10. Hoạt tính enzyme laccase được xác định sau mỗi ngày nuôi cấy, lượng sinh khối và exopolysaccharide thô được xác định sau 12 ngày nuôi cấy.
2.2.6.2. Đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp exopolysaccharide và enzyme laccase, 2 chủng FPT31 và FMD12 được nuôi cấy trên môi trường PGM. Hoạt tính enzyme laccase được xác định sau mỗi ngày nuôi cấy, lượng sinh khối và exopolysaccharide thô được xác định sau 6, 8, 10 và 12 ngày nuôi cấy.
Để đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp exopolysaccharide và enzyme laccase, 2 chủng FPT31 và FMD12 được nuôi cấy trên môi trường PGM có các nguồn nitơ khác nhau gồm các nguồn nitơ vô cơ (2g/l) KNO3, NH4NO3, NH4Cl và nguồn nitơ hữu cơ (1g/l) peptone, cao nấm men, cao thịt. Hoạt tính enzyme laccase được xác định sau mỗi ngày nuôi cấy, lượng sinh khối và exopolysaccharide thô được xác định sau 12 ngày nuôi cấy.
2.2.6.4. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon
Hai chủng nấm FPT31 và FMD12 được nuôi cấy trên môi trường PGM tại trong đó glucose được thay thế bởi các nguồn carbon khác bao gồm glucose, mannose, lactose, xylose và saccharose. Hoạt tính enzyme laccase được xác định sau mỗi ngày nuôi cấy, lượng sinh khối và exopolysaccharide thô được xác định sau 12 ngày nuôi cấy.
2.2.7. Xác định hàm lượng protein, carbonhydrat tổng số và đường khử của EPS thô
Hàm lượng carbonhydrat tổng số trong exopolysaccharide thô được xác định theo Dubois và đtg (1956) [31]. Lấy 100µl dịch mẫu trộn đều với 200µ phenol 5%. Bổ sung 500µ dung dịch H2SO4 đặc vào mẫu và đun sôi trong 5 phút, để nguội về nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ ở bước sóng 490nm. Mẫu đối chứng sử dụng 100µl nước cất thay cho mẫu thí nghiệm. Từ hiệu số OD ở bước sóng 490nm giữa mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng, xác định hàm lượng polysaccharide có trong exopolysaccharide thô dựa vào đường chuẩn glucose.
Hàm lượng đường khử được xác định bằng bằng phương pháp sử dụng DNS. Mỗi mẫu thí nghiệm chứa 200µl mẫu và 600µl DNS. Phản ứng được đun sôi có đậy nút trong 5 phút, làm lạnh về nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Sử dụng 200µl nước cất làm đối chứng. Xác định hàm lượng đường khử dựa vào đường chuẩn glucose.
Hàm lượng protein trong exopolysaccharide tổng số được xác định theo phương pháp Bradford. Lấy 100µl mẫu nghiên cứu bổ sung 500µl dung dịch Bradford, ủ ở nhiệt độ phòng sau 20 phút xác định độ hấp thụ ở bước sóng 595nm. Xác định hàm lượng protein dựa vào đường chuẩn albumin.
2.2.8. Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của một số chủng nấm thuốc
Các chủng vi sinh vật sử dụng để đánh giá khả năng kháng của một số chủng nấm thuốc bao gồm 2 chủng nấm sợi kiểm định là Aspergillus niger và Penicillium italicum; 2 chủng vi khuẩn kiểm định là Bacillus cereus và Micrococus luteus. Các chủng này
được nuôi cấy trên môi trường Capeck (saccharose 30g/l; NaNO3 2g/l; KH2PO4 1g/l; KCl 0,5g/l; MgSO4 0,5g/l; FeSO4 0,01g/l; NaCl 1g/l; aga 18g/l) cho nấm sợi và TSB (Titan biotech, Ấn Độ) cho vi khuẩn.
Sử dụng phương pháp khuếch tán để đánh giá định tính khả năng kháng một số vi sinh vật kiểm định của dịch lên men 7 chủng nấm nghiên cứu. Phương pháp khuếch tán dịch nuôi được tiến hành bằng cách đục các giếng nhỏ có đường kính 5 mm trên các đĩa thạch vừa được cấy vi sinh vật kiểm định. Nhỏ 40µl dịch nuôi cấy nấm đã ly tâm vào các giếng và nuôi trong 2 ngày ở điều kiện thích hợp cho từng loại vi sinh vật kiểm định. Hoạt tính kháng sinh được đánh giá thông qua các vòng ức chế được tạo thành quanh thành giếng. Các thí nghiệm được lặp lại hai lần và dịch môi trường ban đầu được sử dụng làm đối chứng âm.
Bảng 2.1. Thành phần mỗi thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật
Mẫu Môi trường Dịch nuôi cấy nấm Vi sinh vật OD600
Thí nghiệm 1 2,5 ml 2,5 ml + ODtn1
Thí nghiệm 2 1,25 ml 3,75 ml + ODtn2
Đối chứng âm1 2,5 ml 2,5 ml - ODC1
Đối chứng âm 2 1,25 ml 3,75 ml - ODC2
Khả năng ức chế vi sinh vật của dịch nuôi nấm được xác định theo công thức
% ứ𝑐 𝑐ℎế =ODtni − ODci
ODc × 100
2.2.9. Xác định thành phần của polysaccharide từ 2 chủng nấm FPT31 và FMD12
Phổ 1D và 2D NMR ghi trên máy Bruker AVANCE 500. Nồng độ mẫu 3% trong dung môi D2O + 1%TFA, sử dụng DSS là chất chuẩn nội, phổ được ghi ở 70ºC với kỹ thuật đo khử tín hiệu của nước.
2.2.10. Xác định hoạt tính của EPS lên một số chức năng của tế bào
Hoạt tính của EPS thô thu được từ hai chủng nấm FPT31 và FMD12 lên một số chức năng của tế bào được thực hiện bởi công ty BioDetection Systems B.V- BDS, Hà Lan.
Nuôi tế bào trong đĩa 96 giếng
Tế bào được nuôi trong bình tế bào trong môi trường nuôi cấy DMEM có phenol đỏ, bổ sung 7,5% FCS, NEAA. Hút hết dịch nuôi ra khỏi bình nuôi tế bào, rửa tế bào bằng PBS và trysin và để trong tủ ấm 37oC trong 2-3 phút. Bổ sung môi trường xét nghiệm (DMEM không có phenol đỏ, bổ sung 5% DCC-FCS và penicillin) và đảo trộn kỹ, đếm và pha loãng tế bào đến nồng độ xét nghiệm. Hút 100µl vào mỗi giếng. Nuôi tế bào trong 16 tiếng, 37oC trong 5% CO2.
Biểu hiện trên đĩa 96 giếng
- 1µl chất chuẩn được bổ sung vào 1 ml môi trường xét nghiệm, lắc 300 vòng/phút trong 10 phút;
- 20µl mẫu được cổ sung vào 1 ml môi trường xét nghiệm, lắc 300 vòng/ phút trong 10 phút;
- Sau 16 tiếng nuôi, hút hết 100µl môi trường trong giếng và hút 200µl môi trường có chứa chất chuẩn hoặc mẫu cần phân tích cho vào giếng theo sơ đồ ở bảng 2.2.
tránh ảnh hưởng của không khí lên sự phát triển của tế bào;
Bảng 2.2 Sơ đồ hút mẫu cho phân tích sàng lọc CALUX
PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn PBS PBS Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn PBS PBS Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn PBS
PBS Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu PBS
PBS Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu PBS
PBS Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu PBS
PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS
- Nuôi đĩa trong 24 giờ ở 37oC, 5% CO2;
- Hút hết 200µ môi trường ra khỏi giếng và bổ sung 30µl Lysimix, lắc 300 vòng/phút trong 10 phút.
- Đo cường độ phát sáng của luciferase protein bằng máy Luminometer - Dữ liệu được xử lý bằng excel và Graph Prism.
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và phân loại các chủng nấm nghiên cứu
Các mẫu thu thập từ nhiều đợt lấy mẫu và được phân lập từ các khu vực rừng có khí hậu và đặc điểm sinh thái khác nhau gồm Vườn Quốc gia Xuân Sơn- tỉnh Phú Thọ, Vườn Quốc gia Ba Vì- thành phố Hà Nội, A Lưới- tỉnh Thừa Thiên Huế, Vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà, Vườn Quốc gia Mã Đà- tỉnh Đồng Nai và tỉnh Bình Phước và thuộc các dự án, đề tài khác nhau. A Lưới và Mã Đà là hai khu vực bị rải chất độc hóa học nặng nề trong chiến tranh chống Mỹ. Các khu vực lấy mẫu này có khí hậu cũng như hệ sinh vật khác nhau. Các mẫu nấm sử dụng để phân lập có hình thái quả thể nấm rất khác nhau, hầu hết chúng thuộc nhóm nấm cứng. Mười hai chủng nấm đã được phân lập và 10/12 chủng đã được tiến hành định danh. Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch của các chủng nấm phân lập được cũng khác nhau (bảng 3.2). Dựa vào trình tự vùng ITS1-5,8S- ITS2 và so sánh với các trình tự đã được công bố trên GenBank thì 10 chủng nấm đã được xác định thuộc các chi Ganoderma, Trametes, Earliella và Inonotus và Panus
(bảng 3.2).
Trong số 10 chủng đã được phân loại có 6 chủng thuộc chi Ganoderma bao gồm FMD12, FMD13, FMD16, FAL18, FPT47 và FBV334. Các chủng FMD12, FMD13 và FMD16 có độ tương đồng 99% chủng Ganoderma sp. G31 (KR093030) và 97% với
chủng Ganoderma sp. FIRM138 (AJ698114). Ganoderma sp. G31 là nấm được phân lập từ cây dầu cọ bị mục gốc ở vùng Miri, Malaysia và đã được xác định là thuộc loài G. zonatum [168]. Ganoderma sp. FIRM138 là nấm được phân lập từ cây keo tai tượng bị
thối rễ ở Indonesia và được cho là gây nên bệnh thối đỏ rễ ở loài keo này và cũng được xếp vào loài G. philippii [70]. Các chủng FAL18, FPT47 và FBV334 có độ tương đồng 99% với lần lượt với các chủng Ganoderma mastoporum voucher TNM-F0018835 (JX840351), Ganoderma gibbosum strain T160 (KJ654373) và Ganoderma lobatum
isolate JV 0409/13J (KF605675). Bảng 3.1 so sánh độ tương đồng giữa các Ganoderma
Bảng 3.1. Độ tương đồng giữa các nấm thuộc Ganoderma từ các vùng Cặp nấm so sánh Độ tương đồng (%) Cặp nấm so sánh Độ tương đồng (%) FMD12 – FMD13 99 FMD13 – FAL18 95 FMD12 – FMD16 99 FMD13 – FPT47 93 FMD13 – FMD16 99 FMD13 – FBBV334 92 FMD12 – FAL18 95 FAL18 – FPT47 93 FMD12 – FPT47 93 FAL18 – FBV334 92 FMD12 – FBV334 92 FPT47 – FBV334 99
Kết quả nhận được khá thú vị. Các nấm được phân lập ở cùng một khu vực (Mã Đà) hoặc ở hai khu vực gần nhau (Ba Vì và Xuân Sơn) thì có độ tương đồng với nhau cao đến 99%. Các Ganoderma được phân lập ở các khu vực khá xa nhau thì có độ tương đồng thấp. Độ tương đồng của các Ganoderma phân lập từ A Lưới và Mã Đà là 95%,
trong khi đó giá trị này của các Ganoderma từ Mã Đà với Xuân Sơn, Ba Vì hay A Lưới với Xuân Sơn, Ba Vì chỉ khoảng 92-93%. Như vậy, các nấm Ganoderma ở 3 miền Bắc, Trung, Nam là tương đối khác nhau, càng xa nhau về mặt địa lý và điều kiện tự nhiên thì các nấm này càng thể hiện sự khác biệt về mặt di truyền.
Earliella scabrosa
voucher UOC DAMIA D37 (KR706167) phân lập từ Malaysia và Earliella scabrosa
isolate UTAR R8 (KJ867374) phân lập từ Sri Lanka. FAL11 tương đồng 99% với
Inonotus pachyphloeus CBS 193.37 (KM030575) và một số nấm thuộc loài I. pachyphloeus. Chủng FBD167 tương đồng 94% với chủng nấm Panus conchatus isolate
X1234 (JN710579) và Panus conchatus voucher JMH44 (KM267730). Tương tự, FPT24 cũng tương đồng 99% với chủng Trametes elegan strain UMT170-T (KJ654414) và một số nấm thuộc loài T. elegan. Như vậy, dựa trên các đặc điểm về hình thái quả thể, sợi
nấm và kết hợp với các số liệu về độ tương đồng của vùng trình tự ITS của các nấm nghiên cứu với các trình tự trên GenBank, các chủng FPT31, FAL11, FBD167, và FPT24 được đặt tên tương ứng là Earliella. sp FPT31, Inonotus sp. FAL11, Panus sp. FBD167 và Trametes sp. FPT24.
3.2. Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp exopolysaccharide và hoạt tính enzyme laccase của các chủng nấm nghiên cứu
Hầu hết các khuẩn lạc đều tạo màu nâu đỏ trên môi trường thạch có bổ sung chất chỉ thị guaiacol 0,2% chứng tỏ khả năng sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoreductase (laccase) và peroxidase (mangan peroxidase, lignin peroxidase). Bảng 3.2 thể hiện một số đặc điểm của các chủng nấm được phân lập và sàng lọc.
Bảng 3.2. Hình thái các chủng nấm và khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase của chúng
Tên chủng Nguồn gốc Hình ảnh tự nhiên Hình ảnh khuẩn lạc Sinh khối (g/l) Polysaccharide (g/l) Hoạt tính laccase (U/l) Earliella sp. FPT31 (KT965504) Rừng Quốc gia Xuân Sơn 4,64 0,84 7.923 Trametes sp. FPT24 (KT965503) Rừng Quốc
gia Xuân Sơn 4,37 3,24 944
Ganoderma sp.
FPT47 (KT965499)
Rừng Quốc
Ganoderma sp. FBV334 (KT965498) Rừng Quốc gia Ba Vì 6,38 0,36 2.573 FMD11 (Chưa phân loại) Rừng Quốc gia Mã Đà 5,12 2,09 0