2.4.11 Xác định hàm lượng -SH tự do Nguyên lý phản ứng:
5.5’-dithio-bis (2nitrobenzoicacid) + R-SH Thiophenolatanion (màu vàng) Đo độ hấp thụ màu ở 420nm. Sử dụng hệ số ε420nm = 13.000 mM-1 cm-1 tính nồng độ mmol -SH/mg protein.
Các bước tiến hành:
- Cho dung dịch NaCl 9‰ và đệm phosphat pH: 8,0; 0,2M - Chia đều mẫu làm 2 ống, ống thử thêm dung dịch Ellmanm - Đo ở bước sóng 420 nm - Cách tính: D A mmol/ml SH C DTNB
Trong đó: A: mật độ quang học; D: hệ số pha loãng và ε : hệ số hấp thụ, ở 420nm là 13.000 mM-1cm-1. Kết quả tính ra mmol -SH/mg protein ở dịch cần đo.
2.4.12 Xử lý số liệu
Phần mềm Microsoft excel được sử dụng để xử lý số lượng thu được trong quá trình thực nghiệm và tính các giá trị của các tham số thống kê, biểu thị bằng các biểu đồ thích hợp.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin 3.1 Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin
Áp dụng quy trình tinh sạch với các điều kiện tối ưu để thu được hiệu suất tách chiết hoạt chất α-mangostin như nhiệt độ là 60oC, thời gian là 4 giờ, dung môi là ethanol với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 3:1 từ các nghiên cứu trước [10]. Chúng tôi tiến hành tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin từ vỏ quả măng cụt
Garcinia mangostana L.. Kết quả trên hình 3.1 cho thấy, đã thu nhận được cao chiết chứa hoạt chất α-mangostin thô từ vỏ quả măng cụt.
A B C
Hình 3.1. Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin
(A); cất cô quay loại dung môi; (B) bình chiết có chứa cao chiết α-mangostin Sau khi cất cô quay ở 40°C; (C) TLC mẫu cao chiết vỏ quả măng cụt có chứa hoạt chất α-mangostin sau khi tách chiết theo các thông số đã tối ưu
(C: -mangostin chuẩn; M1-M2 là các mẫu tách chiết lặp lại 2 lần thu nhận hoạt chất -mangostin).
Dịch chiết ethanol được tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp phân tách phân đoạn. Cao chiết ethanol thu được chiếm đến 18,8% khối lượng nguyên liệu ban đầu (Bảng 3.1).
Dịch chiết được sử dụng để tinh sạch bằng cột sắc kí silica gel hai lần. Sau khi tinh sạch bằng cột silicagel lần 1, các phân đoạn có chứa α-mangostin ở lần tinh sạch lần một được gộp lại và đưa lên cột tinh sạch lần hai với hệ dung môi là n- hexan : ethyl acetate tỷ lệ 6:1 và 12:1. Các phân đoạn sau đó được kiểm tra với sắc kí bản mỏng TLC.
LC 1 2 3 4 C 5 6 7 8 9 10
Hình 3.2. Ảnh chạy sắc kí bản mỏng sản phẩm tinh sạch α-mangostin qua cột silica gel lần thứ hai với hệ dung môi chloroform: acetone tỷ lệ 5:1 ( C: