Phân tích quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

Mẫu - mangostin và phức mangostin phytosome cũng được gửi sang phòng NanoBioPhotonics, Viện Vật lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để đo kích thước hạt cũng như phổ hấp thụ của các hoạt chất.

Kết quả trên hình 3.7 cho thấy phức mangostin phytosome hấp thụ huỳnh quang ở bước sóng kính sử dụng laser 488nm và đạt cực đại ở bước sóng 318 nm. Phổ UV-vis của mangostin phytosome thấy có sự thay đổi ở vùng bước sóng 318 nm, chứng tỏ có sự tương tác giữa α-mangostin và photphatidylcholin. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự như nghiên cứu của Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự khi đánh giá hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư phổi A549 của hạt nano polymer bọc α-mangostin đã đo quang phổ UV-vis của chất nghiên cứu trong dải bước sóng từ 190-400 nm đã được đo để kiểm tra sự thay đổi về nhóm chức có mặt trong phân tử nano polymer mangostin (NMG) so với α-mangostin (AMG), kết quả thu được cho thấy phổ UV-vis của mẫu NMG có sự thay đổi ở vùng bước sóng 243 nm khi so với mẫu AMG, chứng tỏ tương tác hóa học nội phân tử giữa α-mangostin và chất mang ß-cyclodextrin đã xảy ra [8].

A B

Hình 3.7. Hấp thụ huỳnh quang của phức mangostin phytosome (A) và phổ hấp thụ phân tử UV-VIS của mẫu - mangostin và dạng bào chế

3.4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của mangostin phytosome

Dịch nuôi hoạt hóa của C.albicans, S. aureus được trải đều lên mặt đĩa thạch SDA và LB, sau đó đục giếng thạch và bổ sung 100 µl hoạt chất α-mangostin và mangostin phytosome đã được hòa tan với methanol ở các nồng độ khác nhau vào các giếng để hàm lượng đạt được trong các giếng lần lượt là 200 µg, 400 µg . Đối chứng âm sử dụng là 100 µl methanol, riêng với chủng S. aureus đối chứng dương

sử dụng là 100 µl chloramphenicol 0,2%. Mẫu được ủ 24 giờ ở 37ºC, sau đó quan sát các vòng kháng khuẩn ở các giếng và so sánh.

A B

Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của α-mangostin và mangostin phytosome đối với nấm Candida albicans (A) và vi khuẩn Staphylococcus aureus (B) Chủng Candida albicans(A): 1: Đối chứng âm; 2,5: mẫu mangostin

phytosome với nồng độ tương ứng 200 µg, 400 µg; 3,4: mẫu α-mangostin nồng độ tương ứng 200 µg, 400 µg)

Chủng Staphylococcus aureus (B): 1: Đối chứng âm; 2: Đối chứng dương; 3,4: mẫu mangostin phytosome với nồngđộ tương ứng 200 µg, 400 µg; 5,6: mẫu α- mangostinnồng độ tương ứng 200 µg, 400 µg)

Kết quả sau khi ủ 24 h ở 37ºC cả α-mangostin và mangostin phytosome đều có hoạt tính kháng vi khuẩn S. aureus và C.albicans (Hình 3.8). Kết quả cho thấy ở mẫu đối chứng không có hoạt tính kháng khuẩn, các giếng còn lại đã xuất hiện vòng kháng khuẩn. Ở giếng chứa mangostin phytosome có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn α-mangostin, khi thử hoạt tính kháng khuẩn với Candida albicans, ở nồng độ

400 µg, mangostin phytosome cho đường kính vòng kháng là 1,30,015 cm còn α- mangostin cho đường kính vòng kháng là 0,70,01 cm. Ở nồng độ 200 µg vòng kháng khuẩn đạt 1,2 0,015 cm (mẫu mangostin phytosome) và 0,50,01 cm (mẫu α-mangostin).

Đối với S. aureus khi thử hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ 400 µg, mangostin phytosome cho đường kính vòng kháng là 2,10,01 cm còn α- mangostin cho đường kính vòng kháng là 1,50,02 cm. Chúng tôi nhận thấy mangostin phytosome và α-mangostin đều có hoạt tính kháng S. aureus và C.albicans, kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đỗ Thi Tuyên và cộng

sự về hoạt tính kháng khuẩn của α-mangostin[10]. Chủng S. aureus là liên cầu

khuẩn Gram dương gây bệnh viêm phổi hay nhiễm trùng máu còn C. albicans là

loại nấm gây nhiễm trùng trên bề mặt của khoang miệng, âm đạo và đường tiêu hóa. Do đó, hoạt chất mangostin phytosome có khả năng ức chế được sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn và nấm này sẽ định hướng tạo sản phẩm ứng dụng trong y dược.

3.5 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên động vật thực nghiệm

3.5.1 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hoạt độ peroxidase trong gan

Peroxidase là enzyme có bản chất hemoglobin, oxy hóa cơ chất hữu cơ để chuyển hóa chất độc nội sinh H2O2 thành H2O. Peroxidase là enzyme chống oxy hóa quan trọng đối với cơ thể, có mặt trong tế bào chất và màng ty thể của hầu hết tế bào sinh vật, đặc biệt hoạt động mạnh ở gan và hồng cầu, những cơ quan có vai trò quan trọng trong quá trình giải độc và vận chuyển O2 trong cơ thể. Sự thay đổi hàm lượng và hoạt độ các enzyme chống oxy hóa trong đó có peroxidase là biểu hiện không bình thường của trạng thái sinh lý, cân bằng nội bào khi cơ thể đáp ứng với các chất ngoại sinh.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ xác định hoạt độ peroxidase ở gan mà không xác định hàm lượng peroxidase ở máu, bởi vì cơ thể còn có một số peroxidase giả như hemoglobin và myoglobin có hoạt độ như peroxidase. Catalase cũng là enzyme xúc tác chuyển hóa H2O2 thành nước và nhiều chất khác có ảnh hưởng đến hoạt độ peroxidase.

Bảng 3.4. Hoạt độ peroxidase trong gan chuột Nhóm nghiên cứu n Hoạt độ peroxidase (µg/mg protein)  ± SD Tỷ lệ % so với đối chứng ĐC(-) 11 11,37±1,43 ĐC(+) 11 17,11±3,43 50,4% TN1 16 10,31±3,34 9,3% TN2 16 17,2±2,6 51% TN3 11 13,12±4,48 15% TN4 16 17,61±1,48 54,8% TN5 11 11,62±3,5 50,4%

n: Số cá thể thí nghiệm; : giá trị trung bình, SD: sai số.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 ĐC(-) ĐC(+) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 Nhóm nghiên cứu Ho ạt độ pero xida se ( µg/mg prot ei n)

Hình 3.9. Hoạt độ peroxidase trong gan chuột dưới tác dụng của mangostin phytosome

Cơ chế tác dụng của các chất ngoại sinh lên các enzyme chống oxy hóa là phức tạp và đa dạng. Sự thay đổi hàm lượng và hoạt độ peroxidase phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: liều lượng, bản chất chất ngoại sinh, đường lây nhiễm, thời gian nhiễm, loài và bản chất enzyme. Khi chuột được bổ sung uống mangostin phytosome, chúng tôi quan sát thấy chuột vẫn khỏe mạnh. Hoạt độ peroxidase của

gan ở các nhóm chuột uống CCl4 có bổ sung uống mangostin phytosome đã tăng. Chứng tỏ hoạt chất mangostin phytosome giúp khả năng tổng hợp peroxidase ở gan nhiều hơn mức bình thường hoặc là thúc đẩy hoạt độ enzyme tăng mạnh để làm cho cơ thể tiêu diệt các gốc tự do khi cơ thể bị nhiễm độc CCl4 (Bảng 3.4). Do CCl4 là một chất độc, khi vào cơ thể sẽ tạo ra nhiều gốc tự do làm giảm hoạt độ của enzyme chống oxy hóa, ảnh hưởng đến các chức năng giải độc của gan. Khi quan sát gan chuột, chúng tôi nhận thấy gan bạc trắng, phù nề, nhiều nốt sần. Điều này chứng tỏ gan đã bị tổn thương. Kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy hoạt độ peroxidase đã giảm 9,3% so với nhóm đối chứng.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước. Các kết quả thu được chứng tỏ phytosome mangostin có tác dụng chống oxy hóa trên gan chuột nhiễm độc CCl4 ở liều 0,1 mg/10g thể trọng và liều 0,2 mg/10g thể trọng. Như vậy, chế phẩm phytosome mangostin có ảnh hưởng quan trọng lên sự thay đổi hoạt độ peroxidase ở gan chuột. Trong nghiên cứu của Devi Sampath và cộng sự (2007) cũng khẳng định rằng -mangostin có khả năng ngăn chặn sự suy giảm các enzyme chống oxi hóa như glutathione-S- transferase (GST), glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) do isoproterenol (một loại hợp chất sử dụng trong điều trị tim mạch) gây ra[21].

3.5.2 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hàm lượng MDA trong gan chuột MDA là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid, xảy ra do tác động của các chất oxi hóa, gốc tự do tác động lên các phân tử có bản chất lipid trong tế bào. MDA có thể tham gia phản ứng tạo thành sản phẩm cộng với amino acid tự do hay với protein để hình thành những liên kết ngang trong những phân tử protein này, khi đó có thể cảm ứng gây biến đổi mạnh mẽ những đặc tính hóa sinh của chúng Hàm lượng MDA được coi là chất chỉ thị quan trọng để đánh giá mức độ ảnh hưởng và tốc độ phản ứng peroxy hóa lipid diễn ra trong tế bào, cũng như có thể xác định được hàm lượng các gốc tự do, từ đó cho thấy mức độ, tính chất nguy hại của những tác nhân lạ được đưa vào cơ thể sinh vật.

Bảng 3.5. Hàm lượng MDA trong gan chuột dưới tác dụng của phytosome mangostin Nhóm nghiên cứu n Hàm lƣợng MDA (mol/mg protein) × 10-4  ± SD Tỷ lệ % so với đối chứng ĐC(-) 11 443±19,55 ĐC(+) 11 410,96±12,55 7,2% TN1 16 760,58±22,814 71,6% TN2 16 606,39±22,009 36,9% TN3 11 681,75±14,691 12,4% TN4 16 487,38±15,335 10% TN5 11 352,84±10,538 20%

n: Số cá thể thí nghiệm; : giá trị trung bình, SD: sai số.

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 ĐC(-) ĐC(+) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 Nhóm nghiên cứu Hà m lƣợng M DA ( µmol/ mg prot ei n)

Hình 3.10. Sự thay đổi hàm lượng MDA trong gan dưới tác dụng của mangostin phytosome.

Hàm lượng MDA trong gan ở nhóm uống CCl4 tăng rõ rệt, tăng 71,6% so với nhóm đối chứng. Điều này cho thấy phản ứng peroxy hóa lipid trong tế bào gan do tác động của CCl4 ở nhóm chuột bị nhiễm độc diễn ra khá mạnh mẽ. Ở nhóm TN2, nhóm chuột nhiễm độc CCl4 được điều trị bằng mangostin phytosome liều 0,1

mg/10 g thể trọng, hàm lượng MDA giảm so với nhóm nhiễm độc CCl4 khoảng 34,7% nhưng vẫn tăng gần với nhóm đối chứng (Bảng 3.7). Nguyên nhân có thể là do tác dụng ngăn cản quá trình peroxy hóa lipid bởi CCl4 của mangostin

phytosome. Thêm vào đó, ở nhóm TN5 chỉ uống

-mangostin liều 0,2 mg/10 g thể trọng, hàm lượng MDA trong gan giảm 20% so với nhóm đối chứng, giảm 53% so với nhóm nhiễm độc CCl4. Trong nghiên cứu của Williams và cộng sự (1995) đã chứng minh rằng mangostin có khả năng bảo vệ các phân tử hàm lượng thấp có bản chất là lipoprotein (LDL) tránh khỏi sự oxi hóa của các ion kim loại (Cu2+) ở nồng độ 100 mM ở thời điểm 4 giờ, ở điều kiện in vitro [53]. Tương tự, Mahabusarakam và cộng sự (2000) đã chứng minh rằng - mangostin và các dẫn xuất tổng hợp của nó có thể ngăn chặn sự oxi hóa phân tử LDL. Sự thay đổi cấu trúc -mangostin, thay C3 và C4 bằng các dẫn xuất aminoethyl làm tăng cường hoạt hoạt động chống oxi hóa, trong khi thay bằng các gốc methyl và acetate làm giảm hoạt động chống oxi hóa [35]. Kết quả nghiên cứu cho thấy mangostin phytosome thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, không chỉ có tác dụng bảo vệ gan khỏi bị nhiễm độc ngoại sinh mà còn bảo vệ gan khỏi các gốc oxi hoá nội sinh.

3.5.2 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hàm lượng nhóm -SH trong gan chuột chuột

Nhóm -SH đóng vai trò rất quan trọng trong cấu trúc bậc cao và chức năng của các đại phân tử như protein (enzyme, lipoprotein) trong cơ thể sống. Nhóm -SH cũng như các nhóm chứa lưu huỳnh nói chung còn tham gia vào quá trình tăng sinh tế bào, bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm độc. Người ta đã nghiên cứu và quan sát thấy có sự liên quan chặt chẽ giữa số lượng nhóm -SH trong phân tử protein của cơ thể(như dịch cơ thể, máu và các mô) với một số bệnh lý nhất định. Hàm lượng nhóm -SH trong tế bào và cơ thể càng cao chứng tỏ khả năng bảo vệ cơ thể khỏi sự tấn công của các nhân tố gây stress oxy hóa càng lớn. Tại gan, việc giảm hàm lượng nhóm -SH sẽ gây tổn thương gan.

Bảng 3.6. Hàm lượng nhóm -SH trong gan chuột dưới tác dụng của phytosome mangostin Nhóm nghiên cứu n Hàm lƣợng nhóm SH (mol/mg protein)× 10-4  ± SD Tỷ lệ % so với đối chứng ĐC(-) 11 217,29±57,2 ĐC(+) 11 219,75±79,5 1,1% TN1 16 204,79±93 5,7% TN2 16 224,52±75,5 3,32% TN3 11 209,68±89,5 3,5% TN4 16 223,64±76,6 2,9% TN5 11 210,52±162,4 3,1%

n: Số cá thể thí nghiệm; : giá trị trung bình, SD: sai số

0 50 100 150 200 ĐC(-) ĐC(+) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 Nhóm nghiên cứu H àm lƣợng nhóm SH-( µmol /mg protei n)

Hình 3.11. Sự thay đổi hàm lượng nhóm -SH trong gan dưới tác dụng của mangostin phytosome

Kết quả trên bảng 3.8 cho thấy hàm lượng nhóm trong gan ở nhóm uống CCl4 giảm 5,7% so với nhóm đối chứng. Điều này cho thấy các liên kết disulfua của phân tử protein trong tế bào gan do tác động của CCl4 ở nhóm chuột bị nhiễm độc bị phá vỡ khá nhiều dẫn đến suy giảm hàm lượng protein trong gan. Ở nhóm TN2,

nhóm chuột nhiễm độc CCl4 được điều trị bằng mangostin phytosome liều 0,1 mg/10 g thể trọng, hàm lượng nhóm SH đã tăng 3,32% so với nhóm đối chứng. Nguyên nhân có thể là do tác dụng ngăn cản quá trình phá huỷ nhóm -SH bởi CCl4

của mangostin phytosome. Thêm vào đó, ở nhóm TN4 nhóm chuột nhiễm độc CCl4

được điều trị bằng mangostin phytosome liều 0,2 mg/10 g thể trọng, hàm lượng nhóm -SH trong gan cũng tăng 2,9% so với nhóm đối chứng, tăng 8,6% so với nhóm nhiễm độc CCl4. Khi chuột uống CCl4 chuột sẽ bị nhiễm độc ở gan dẫn đến phá hủy protein làm hàm lượng nhóm -SH bị suy giảm, còn khi chuột được điều trị bằng mangostin phytosome thì hàm lượng nhóm -SH tăng lên đáng kể so với nhóm đối chứng và nhóm bị nhiễm độc CCl4 chứng tỏ mangostin phytosome đã làm tăng hàm lượng nhóm -SH, bảo vệ gan khỏi bị nhiễm độc.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

1. Hoạt chất α-mangostin tinh sạch được tách chiết từ vỏ quả măng cụt chiếm 0,142% khối lượng thô ban đầu và độ sạch đạt 98,5% (HPLC). Hoạt chất có dạng tinh thể màu vàng, nhiệt độ nóng chảy đạt 204 - 205°C, Rf = 0,7 cm trong hệ dung môi dichlomethane : methanol với tỷ lệ 96:4.

2. Điều chế thành công mangostin phytosome có dạng bột màu vàng, dẻo, hơi dính, nhiệt độ nóng chảy đạt 105-106°C, hấp thụ huỳnh quang cực đại ở bước sóng 318 nm. Mangostin phytosome có hoạt tính kháng lại một số chủng vi khuẩn và nấm gây bệnh ở người như S. aureus, C.albicans ở nồng độ 200 g và 400 g.

3. Mangostin phytosome thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan khỏi sự tấn công của chất độc có tính oxi hóa mạnh là CCl4. Thể hiện bằng tác dụng làm tăng hoạt độ peroxidase, tăng hàm lượng nhóm -SH và làm giảm hàm lượng MDA ở gan chuột trong các nhóm nghiên cứu.

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục tạo sản phẩm mangostin phytosome và thử nghiệm ảnh hưởng lên một số các enzyme chống oxy hóa như superoxide dismutase, glutathione peroxidase và đánh giá trạng thái chống oxy hóa toàn phần để ứng dụng tạo sản phẩm chống oxy hóa giải độc gan.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Trương Văn Châu, Trần Hồng Quang, Đỗ Ngọc Liên (2004), "Đặc tính kháng khuẩn của các hợp chất phenolic ở một số loài cây thuộc chi Garcinia L. " Tạp

chí Sinh học 26(4): pp. 59-62.

2. Đào Hùng Cường, Đỗ Thị Thuý Vân (2010), "Nghiên cứu chiết tách và xác định xanthone từ vỏ quả Măng cụt (Garcinia mangostin L)", Tạp chí Khoa học

và công nghệ, Đại học Đà nẵng, 5(40): pp. 167-173.

3. Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đỗ Thị Hồng Cẩm (1997), "Hoạt độ peroxidase ở một số tổ chức thực vật", Tạp chí Y học Việt Nam, 6: pp. 39-43.

4. Hoàng Văn Huấn (1998), "Nghiên cứu sự biến đổi hệ thống enzyme

cytochrome P450 và một vài thông số hóa sinh có liên quan nhiễm độc thực nghiệm nhiên liệu lỏng tên lửa", Luận văn thạc sỹ y học, Học viện Quân Y,

Bộ Giáo dục và Đào tạo - Bộ Quốc Phòng.

5. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học Hà Nội. 567-568.

6. Hoàng Công Minh (2001), "Nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp

dichlorodiethyl sulfide với chlorovinyl dichlorarsine lên một số chỉ tiêu độc học, hóa sinh, huyết học trên động vật thực nghiệm và tác dụng của thuốc điều trị", Luận án tiến sỹ y học, Học viện Quân y, Bộ Giáo dục và Đào tạo - Bộ