ruột tôm
Tiến hành thu mẫu tôm (n = 3) tại mỗi thời điểm ngày 0, 1, 3, 7, 14 và 28 trong quá trình nuôi tôm, ký hiệu tương ứng là 0 D, 1 D, 3 D, 7 D, 14 D, và 28 D. Sau đó giải phẫu, thu toàn bộ ruột tôm vào ống eppendoft 2 ml vô trùng, giã nhuyễn bằng que giã
vô trùng, bổ sung 1 ml NaCl 0,9%, để 15 phút rồi vontex 1 phút để hòa tan vi sinh vật trong ruột tôm vào NaCl 0,9%. Pha loãng dịch đồng nhất chứa vi sinh vật ruột tôm đến độ pha loãng 104. Cấy trải 100 µl dịch pha loãng trên đĩa thạch LB, mỗi nồng độ lặp lại 2 lần. Số khuẩn lạc thu được trên đĩa là cơ sở để tính toán xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm. Trong đó, khuẩn lạc mang màu sắc và hình thái đặc trưng (khuẩn lạc tròn, hơi lồi, bề mặt nhẵn, màu vàng cam), nghi ngờ B. aquimaris SH6 được kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA.
Để đánh giá thành phần các chủng vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm, quá trình phân lập được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch, sau đó lựa chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch, thực hiện tách chiết DNA tổng số bằng bộ Kit tách chiết Anapure Bacterial DNA Mini Kit (ANABIO R&D, Việt Nam). Sản phẩm tách DNA tổng số được kiểm tra chất lượng tách chiết bằng phương pháp điện di gel elctrophoresis xác nhận băng DNA tổng số và định lượng bằng đo quang phổ với máy quang phổ Nano DropOne microvolume UV-VIS (Thermo Scientific - Hoa Kỳ). Cuối cùng, sản phẩm tách chiết DNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16s rRNA (cặp mồi F27: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ và R1527: 5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’ [48]) (thành phần phản ứng PCR được trình bày như Mục 2.1.5) cho sản phẩm có kích thước 1500 bp. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ Kit Anapure PCR Product & Gel Purification Mini Kit (ANABIO R&D, Việt Nam), giải trình tự 16S rRNA (1st BASE DNA Sequencing Division, Singapore) và so sánh với trình tự có sẵn trên ngân hàng gen NCBI, độ tương đồng > 98% được lựa chọn để xác định loài tương ứng với khuẩn lạc phân lập được. Từ kết quả giải trình tự, kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch (CFU/g ruột) có thể phân tích và xác định tỷ lệ phần trăm mỗi chủng.