trắng
Bào tử là trạng thái ít hoạt động sinh học giúp vi khuẩn tiết kiệm năng lượng trong điều kiện nghèo dinh dưỡng hay môi trường khắc nghiệt, để kích thích tăng trưởng của vật chủ, các chủng probiotic phải sản sinh một số enzyme tiêu hóa như protease, amylase, … Nghĩa là, các bào tử này phải phá hủy lớp vỏ peptidoglycan bảo
vệ và trở thành trạng thái hoạt động sinh học. Hiện tượng này gọi là “Sự nảy mầm”. Trong nghiên cứu này, để đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử SH6, chỉ thị sinh học phân tử là mức độ biểu hiện gen α-amylase (BaqA) được lựa chọn do gen này chỉ biểu hiện khi B. aquimaris SH6 tồn tại trạng thái tế bào sinh dưỡng. Chúng tôi đã xác định chính xác đoạn trình tự 110 bp mã hóa cho gen BaqA ở B. aquimaris SH6, xác định được cặp mồi BaqA-SH6, (Hình 3.6) và chứng minh độ đặc hiệu của cặp mồi này. Từ đó, thiết kế TaqMan probe gắn tín hiệu huỳnh quang FAM cho phản ứng Real-time PCR (Bảng 2.3).
Để đánh giá mức độ biểu hiện gen BaqA-SH6, mẫu ruột tôm ăn bào tử B. aquimaris SH6 (1 × 108 CFU/g) được thu tại các thời điểm: 0 h, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h, 12 h, 24 h, 2 D, 4 D và 7 D. Quy trình tách chiết chuẩn bị mẫu và phản ứng Real-time PCR được trình bày trong phần phương pháp. Hình 3.7 thể hiện đường tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Real-time PCR nhân gen BaqA-SH6 trên một số mẫu đại diện (0 h, 4 h, 24 h và 7 D).
Dựa vào giá trị Ct của phản ứng Real-time PCR trên mẫu thực và mẫu chuẩn, chúng tôi xác định được bào tử SH6 bắt đầu nảy mầm với tỷ lệ rất thấp từ thời điểm 4 h cho đến 12 h (0,03 - 0,07%). Kết quả này đồng nhất với một số nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng quá trình nảy mầm của bào tử Bacillus sp. có thể diễn ra sau vài tiếng trong điều kiện môi trường giàu dinh dưỡng [24, 47]. Sự nảy mầm của bào tử SH6 tiếp tục tăng lên và đạt ngưỡng ở thời điểm 24 h (27,87%) và giảm dần tại các thời điểm 2 D, 4 D và 7 D (tỷ lệ nảy mầm tương ứng là 20,82, 6,97 và 4,55%) (Hình 3.8). Lý giải cho sự giảm tỷ lệ nảy mầm này, giả thiết được đưa ra là do tôm không được tiếp tục cho ăn trong thời gian nuôi, đồng thời không bổ sung thêm bào tử SH6, điều này dẫn đến việc ruột tôm không đủ dinh dưỡng cho sự tăng sinh của tế bào SH6. Vì vậy, tế bào SH6 trong ruột có thể bị chết đi hoặc tái tạo trạng thái bào tử do điều kiện dinh dưỡng nghèo nàn [49]. Đồng nghĩa với số lượng tế bào sinh dưỡng SH6
trong ruột tôm giảm đáng kể, dẫn tới mức độ biểu hiện gen BaqA cũng giảm tương ứng.
Hình 3.7: Đánh giá sự nảy mầm trong ruột tôm. Đường tín hiệu huỳnh quang FAM của phản ứng Real-time PCR nhân đoạn gen đặc hiệu BaqA-SH6 trên một số
mẫu đại diện: 0 h, 4 h, 24 h, 7 d và các điểm chuẩn 100%, 20%.
Như vậy, rõ ràng rằng bào tử SH6 đã bám vào thành ruột và nảy mầm trong ruột tôm và quá trình này được mô hình hoá trong Hình 3.9. Số phận của bào tử SH6 trong ruột tôm theo giả thiết ở trên được mô phỏng bởi một phần ruột tôm, trong tổng số bào tử được tôm tiêu hóa, đi vào ruột, chỉ có một phần có thể bám lại trên thành ruột và một phần lớn bị đào thải ra ngoài qua phân. Trong số bào tử bám lại trên thành ruột, cũng chỉ có một phần rất nhỏ nảy mầm, trở thành trạng thái tế bào sinh dưỡng (< 0,1 % tại 4 - 6 h đầu). Phần lớn bào tử còn lại chỉ bám trên thành ruột mà chưa thể nảy mầm trong khoảng thời gian ngắn.
Hình 3.8: Tỷ lệ nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng (%).
Hình 3.9: Số phận của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng