thẻ chân trắng
Để xác định vai trò và tác dụng của bào tử SH6 đối với hệ miễn dịch của tôm, các thử nghiệm đã được tiến hành đối với một số chỉ thị sinh học tại thời điểm 28 D so với 0 D. Đầu tiên là chỉ thị sinh học phân tử - mRNA Rho. Mức độ biểu hiện gen Rho
được đánh giá bằng phản ứng Real-time PCR sử dụng tín hiệu huỳnh quang SYBR Green (xem phần Phương pháp). Kết quả thu được được trình bày trong Hình 3.10A.
Hình 3.10: Chỉ số miễn dịch ở tôm tại ngày 0 và ngày 28. A - Mức độ biểu hiện
mRNA Rho. B - Mức độ biểu hiện mRNA Ran. *P<0,05, **P<0,01.
Trong đó, mức độ biểu hiện mRNA Rho ở tôm thuộc nhóm "SH6 spore" tăng lên đáng kể sau 28 ngày nuôi (2-ΔΔCt = 23,2), cao hơn gấp 8.1 (P < 0,05) lần so với tôm ở nhóm “ĐC” (2-ΔΔCt = 2,8). Trong khi đó, ở nhóm "Carophyll" và "SH6 carotenoid",
mức độ biểu hiện gen Rho khá thấp, chỉ sấp xỉ nhóm “ĐC” (giá trị 2-ΔΔCt lần lượt là 4,4 và 3,4). Ngoài mRNA Rho, mRNA Ran cũng được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của bào tử SH6 đối với hệ miễn dịch tôm. Rõ ràng rằng, mức độ biểu hiện gen Ran tăng đáng kể ở ngày 28 so với ngày 0. Tuy nhiên, chúng tôi phát hiện ra rằng, mRNA Ran
biểu hiện ở mức rất cao ở tôm thuộc nhóm "Carophyll" (2-ΔΔCt = 367, cao hơn 6 lần) và "SH6 carotenoid" (2-ΔΔCt = 1459, cao hơn 25 lần) so với nhóm “ĐC” (2-ΔΔCt = 58), trong khi chỉ số này ở nhóm tôm "SH6 spore" khá thấp (2-ΔΔCt = 38) và không khác biệt so với nhóm “ĐC” (Hình 3.10B). Một số nghiên cứu trước đây đã đưa ra bằng chứng chứng minh rằng Rho và Ran là một trong các thành phần trong hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng. Cụ thể, tác giả Kim và cộng sự (2004) [36], Pan và cộng sự (2005) [56], Han và cộng sự (2007) [28] đã chỉ ra rằng tôm kháng vi rút đốm trắng cho thấy mức độ biểu hiện gen Rho và Ran tăng lên đáng kể so với tôm không kháng vi rút, đồng nghĩa với việc tăng biểu hiện gen Rho hoặc Ran là biểu hiện hệ miễn dịch của tôm được tăng cường. Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện gen Rho tăng lên một cách rõ rệt ở nhóm ăn bào tử B. aquimaris SH6. Điều này chứng tỏ việc cho tôm ăn bào tử với nồng độ thích hợp đem lại hiệu quả tăng cường miễn dịch cho tôm. Riêng với chỉ thị sinh học phân tử thứ 2 là gen Ran, chúng tôi phát hiện ra rằng, nhóm tôm ăn bào tử SH6 có mức độ biểu hiện gen Ran không tăng so với nhóm “ĐC”. Theo như báo cáo của Pan và cộng sự (2005), Ran liên quan trực tiếp tới quá trình vận chuyển một số chất qua nhân, và tăng biểu hiện ở tôm kháng vi rút. Vậy, câu hỏi đặt ra là, khi không sử dụng vi rút như một tác nhân xâm nhập thì việc tăng cường hệ miễn dịch có liên quan một cách tuyến tính với mức độ biểu hiện gen Ran không? Trong trường hợp sử dụng bào tử SH6, có thể hệ miễn dịch của tôm được tăng cường một cách đáng kể (mức độ biểu hiện gen Rho tăng lên 8 lần so với nhốm “ĐC”). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, tác nhân ảnh hưởng đến hệ miễn dịch của tôm được sử dụng là bào tử vi khuẩn, là những phân tử có kích thước lớn hơn nhiều so với vi rút. Do vậy, giả thiết hợp lý là hệ thống miễn dịch của tôm sẽ kích hoạt cơ chế thực bào dẫn tới việc tăng một cách đáng kể biểu hiện gen Rho. Trong khi, bào tử vi khuẩn không tác động trực tiếp đến quá trình
vận chuyển các chất qua nhân, dẫn đến không thay đổi mức độ biểu hiện gen Ran. Vì vậy, mức độ biểu hiện gen Ran ở nhóm “SH6 spore” không khác biệt so với nhóm “ĐC”. Điều này cần được làm sáng tỏ trong các nghiên cứu tiếp theo về tác động của bào tử ci khuẩn đến mức độ biểu hiện gen Ran nói riêng và hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng nói chung.
Ngoài chỉ thị sinh học phân tử là mRNA Rho/Ran, PO và SOD là 2 chỉ tiêu được sử dụng khá phổ biến để đánh giá khả năng miễn dịch ở tôm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm đo đạc và xác định hoạt tính enxyme PO và SOD tại các thời điểm 0 D và 28 D của quá trình nuôi tôm. Hình 3.11A thể hiện hoạt tính enzyme PO giữa các nhóm thí nghiệm. Dựa vào kết quả biểu thị trên Hình 3.11A, có thể thấy rằng hoạt tính enzyme PO đạt mức tương đối đồng đều ở cả bốn nhóm thí nghiệm. Đến ngày 28, chỉ số này tăng lên rõ rệt ở tất cả các nhóm. Trong đó, sự tăng trưởng mạnh mẽ nhất được thể hiện ở tôm thuộc nhóm "SH6 spore", cụ thể, hoạt tính enzyme PO ở nhóm này cao hơn gấp 2 lần so với nhóm “ĐC” (ΔA490: 0,63 và 0,29, P < 0,01). Trong khi đó, giá trị ΔA490 của tôm thuộc nhóm đối chứng dương lần lượt là: "Carophyll" (ΔA490: 0.33), "SH6 carotenoid" (ΔA490: 0,35, P < 0,05), các giá trị này cho thấy hoạt tính enzyme PO ở hai nhóm này cũng tăng lên so với nhóm “ĐC” và so với ngày 0, nhưng khác biệt này không có hoặc có ý nghĩa thống kê thấp hơn nhiều so với nhóm "SH6 spore". Kết quả tăng hoạt tính enzyme PO này là bằng chứng chứng minh đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng đã tăng lên một cách đáng kể khi tôm được cho ăn với thức ăn bổ sung bào tử B. aquimaris SH6. Điều này tuong đồng với một số nghiên cứu đã có trước đây về mối liên hệ giữa đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng và hoạt độ enzyme PO, thể hiện vai trò của các chủng probiotic, như nghiên cứu của Nguyen và cộng sự (2008) trên đối tượng tôm thẻ chân trắng bị nhiễm vi rút đốm trắng [51]. Đồng thời củng cố kết quả của nghiên cứu trước đó của Ngo và cộng sự (2016) về ảnh hưởng của B. aquimaris SH6 đến hoạt tính enzyme PO của tôm [48].
Hình 3.11: Chỉ số miễn dịch ở tôm tại ngày 0 và ngày 28. A - Hoạt tính enzyme PO. B - Hoạt tính enzyme SOD. *P<0,05; **P<0,01.
Đối với chỉ thị SOD, Hình 3.11B chỉ ra rằng hoạt tính enzyme SOD tại ngày 28 của các nhóm "Carophyll", "SH6 spore" và "SH6 carotenoid" đều tương đương nhau (lần lượt là 51,78; 50,2 và 52,86 unit/g tôm), cao hơn so với nhóm “ĐC” cùng ngày (40,94 unit/g tôm). Tuy nhiên, hoạt tính enzyme SOD ở tôm thuộc cả 4 nhóm ở ngày 28 đều không thay đổi so với ngày 0, thậm chí chỉ số này còn giảm ở nhóm “ĐC”. Trong khi ở nhóm “ĐC”, chỉ số SOD giảm đáng kể giữa ngày 28 so với ngày 0. Mặc dù cả Rho và SOD đều là hai chỉ số miễn dịch liên quan đến cơ chế miễn dịch của tôm
thẻ chân trắng thông qua cơ chế thực bào và đã có nghiên cứu chứng minh rằng Rho là một protein liên quan đến quá trình hình thành superoxide. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện được sự tăng lên đáng kể về mức độ biểu hiện gen Rho, trong khi không phát hiện có sự tăng lên về hoạt độ enzyme SOD ở tôm được ăn bào tử SH6. Để lý giải cho kết quả này, chúng tôi cho rằng: Mức độ biểu hiện gen Rho tăng lên rõ rệt, chứng tỏ tác dụng tăng cường miễn dịch của bào tử SH6. Tuy nhiên, việc xác định hoạt độ enzyme SOD sử dụng phương pháp hóa sinh học, dựa vào các phản ứng hóa học mô phòng bên ngoài tế bào để đo đạc, đánh giá hoạt tính enzyme SOD. Phương pháp này có thể không đủ chính xác để đo đạc được những thay đổi nhỏ, dẫn đến khi trình bày số liệu dưới dạng biểu đồ không thể quan sát được những thay đổi này. Trong khi sử dụng phương pháp sinh học phân tử (Real-time PCR) đánh giá biểu hiện gen lại có tính chính xác cao, có khả năng phát hiện những thay đổi rất nhỏ để biểu thị trên biểu đồ với giá trị chênh lệch quan sát được. Như vậy, chúng tôi giả thiết rằng, việc gia tăng mức độ biểu hiện gen Rho, là cơ sở chứng minh sự tăng cường tổng hợp superoxide, tuy nhiên, chưa đủ mạnh để biểu thị bằng giá trị hoạt tính enzyme SOD. Do vậy, cần có những nghiên cứu tiếp theo với các đối tượng tôm có kích thước và trọng lượng lớn hơn cũng như bố trí thí nghiệm với thời gian dài hơn để đánh giá chính xác hơn về chỉ tiêu miễn dịch tôm – SOD.
Từ những kết quả đánh giá các chỉ tiêu miễn dịch trên, có thể kết luận rằng, bào tử SH6 nồng độ 5 × 106 CFU/g thức ăn có tác dụng tăng cường đối với 2 chỉ thị miễn dịch ở tôm thẻ chân trắng là mRNA Rho và hoạt tính enzyme PO.