Dựa vào trình tự tương đồng của gen mã hóa enzyme α-amylase ở B. aquimaris
MKSC 6.2 và các chủng Anocybacter spp., nghiên cứu này đã thiết kế được cặp mồi suy biến nhân đoạn gen BaqA có kích thước 110 bp ở B. aquimaris (Hình 2.6). Tuy nhiên, cặp mồi suy biến không hoàn toàn đặc hiệu khi nhân đoạn gen BaqA ở B. aquimaris SH6 mà còn nhân được đoạn gen BaqA ở chủng B. aquimaris khác như B. aquimaris SH1 (Mã: KF443805).
Để xác định chính xác trình tự BaqA-SH6 và cặp mồi đặc hiệu cho PCR. Khuẩn lạc E. coli DH5-α mang gen tái tổ hợp (BaqA-SH6) được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi vector (M13) cho sản phẩm PCR kích thước 305 bp (chứa 110 bp gen BaqA-SH6 và 205 bp đoạn gen M13), và điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.4. Trong đó, chỉ có khuẩn lạc số 10 mang gen tái tổ hợp chứa trình tự gen BaqA-SH6. Sản phẩm PCR mang gen BaqA-SH6 được tinh sạch và giải trình tự. Kết quả giải trình tự cung cấp trình tự chính xác đoạn gen BaqA-SH6 của B. aquimaris
SH6 với kích thước 110 bp (Hình 3.5).
Hình 3.4: Điện di gel biến tính sản phẩm PCR mồi M13 để sàng lọc khuẩn lạc
mang gen tái tổ hợp.
Giếng M: Ladder 100 bp (Enzynomics, Hàn Quốc), giếng 1: đối chứng âm phản ứng PCR, giếng 2-10: sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi M13 với khuôn là DNA tách từ
khuẩn lạc biến nạp.
Dựa trên đoạn trình tự gen đã được giải này chúng tôi thiết kế cặp mồi và probe đặc hiệu (Bảng 2.3) cho gen BaqA-SH6 sử dụng trong phản ứng real time PCR để đánh giá sự nảy mầm của bào tử. Hình ảnh điện di gel electrophoresis sản phẩm PCR đánh giá độ đặc hiệu của cặp mồi BaqA-SH6, sử dụng khuôn là DNA từ một số nguồn khác nhau cho thấy băng điện di kích thước 110 bp, đặc hiệu với DNA của chủng B. aquimaris SH6 (Hình 3.6). Như vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tìm ra đoạn trình tự 110 bp mã hóa enzyme α-amylase ở B. aquimaris SH6 và thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR nhân đoạn gen BaqA-SH6 (Hình 3.5 và Bảng 2.3).
Hình 3.6: Điện di gel electrophoresis sản phẩm PCR nhân đoạn gen BaqA- SH6: Giếng M – Ladder 100 bp (Enzynomics, Hàn Quốc); giếng 1 – đối chứng âm phản ứng PCR; giếng 2,3 - tế bào sinh dưỡng B. aquimaris SH6; giếng 4 - B. subtilis PY79, giếng 5 - B. indicus HU36; giếng 6 - B. aquimaris SH1 (Mã: KF443805); giếng
7 - B. marisflavi SH8 (Mã: KF443806); giếng 8,9 - ruột tôm không ăn bào tử SH6 (nhóm “ĐC”); giếng 10, 11 - ruột tôm ăn bào tử SH6 (nhóm “SH6 spore”).